利用本氏烟高效包装豇豆花叶病毒载体实现定制RNA的精准封装与递送

本研究创新性地利用豇豆花叶病毒(CPMV)复制-包装偶联机制，在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中实现4.6kb以下异源RNA的高效封装。通过开发非复制型RNA-1载体(pHREAC-RNA-1)，将目标RNA包装效率提升5倍，并消除载体RNA污染，为RNA疫苗的常温储运提供新策略。

　　

RNA封装技术的突破性进展

ABSTRACT

豇豆花叶病毒(CPMV)的双组分特性被巧妙利用，通过在本氏烟中瞬时表达，实现了定制RNA分子在病毒颗粒中的特异性封装。研究者将目标RNA序列置于CPMV RNA-2的5'和3'非翻译区(UTR)之间，使其能被RNA-1编码的复制酶识别。与以往结论不同，本研究证实无需自我复制版本的RNA-1即可实现目标RNA的复制与包装，且非复制型RNA-1不仅能避免RNA-1的包装，还能提高目标RNA的包装产量。

2 Results

2.1 数kb长度的RNA可通过封装稳定保存

通过将3.9kb的SARS-CoV-2刺突蛋白(S)基因插入pEAQ-AgeI载体，成功获得约4.6kb的RNA包装产物。电镜观察显示，封装后的RNA在+4°C储存5个月仍保持完整。类似地，登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKAV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)的结构蛋白编码RNA(4.5kb、3.0kb和3.1kb)均被高效封装，证实该系统对多种长度和序列RNA的广泛兼容性。

2.2 密码子优化非封装必需

比较野生型和植物密码子优化的埃博拉病毒(EBOV)糖蛋白(GP)编码序列发现，两者封装效率相当(1.7μg vs 1.2μg)。这一发现对设计哺乳细胞表达系统尤为重要，因为天然序列可能更适于在靶细胞中翻译。

2.3 非复制型RNA-1支持RNA-2复制

突破性地发现，去除RNA-1的5'UTR或替换为合成UTR(5S0)的pHREAC-RNA-1虽不能自我复制，但能有效支持RNA-2复制。测序揭示早期研究使用的RNA-1-32E突变体存在A325D多蛋白突变，这才是其丧失复制功能的真正原因。

2.4 无RNA-1复制的改良RNA-2封装

使用pHREAC-RNA-1包装禽流感血凝素(avHA)RNA时，仅检测到2.4kb目标条带，且RNA产量较传统系统提高4.3倍。氯化铯密度梯度离心证实，新系统可完全避免RNA-1污染，获得更纯净的目标RNA颗粒。

2.5 RNA封装长度上限探索

当包装的CHIKV-ZIKAV嵌合RNA长度超过RNA-1(6kb)10%达6.6kb时，仍可检测到完整封装但产量显著降低；延长27%至7.6kb时则无法获得完整包装产物，提示6kb是CPMV颗粒的物理包装极限。

3 Discussion

该研究建立了高效、灵活的RNA包装平台，其核心优势在于：1) 消除RNA-1污染提升生物安全性；2) 非复制型RNA-1使目标RNA产量提高5倍；3) 支持多种病毒抗原编码RNA的稳定封装。特别值得注意的是，封装后的RNA在4°C长期保存仍保持完整，解决了RNA疫苗冷链运输的瓶颈问题。虽然CsCl梯度离心目前仍是分离空颗粒的有效方法，但研究者建议可开发基于颗粒稳定性差异的替代纯化方案以便放大生产。

4 Materials and Methods

所有RNA-2衍生载体均基于pEAQ-AgeI构建，目标序列通过AgeI-XhoI位点插入CPMV RNA-2 UTRs之间。RNA-1变体通过重叠延伸PCR改造pEAQ-RNA1-Int获得。农杆菌(LBA4404)浸润本氏烟叶片6-7天后，采用PEG沉淀结合氯化铯密度梯度离心纯化病毒样颗粒。RNA提取采用微球菌核酸酶消化结合酚-氯仿抽提法，通过变性琼脂糖凝胶电泳分析。