基于力敏微流控悬臂的飞升级冷冻电镜样品制备技术实现单细胞亚细胞靶向活检

这篇研究开创性地开发了AFM4cryoEM系统，通过微流控原子力显微镜（AFM）悬臂实现204 fL级生物样本的精准操控，首次完成单细胞亚细胞成分靶向提取与冷冻电镜（cryoEM）直接成像。该系统整合荧光显微镜定位与力反馈控制，突破传统样本制备中细胞原位信息丢失的瓶颈，为研究天然状态下生物大分子构象及细胞器互作提供新范式。

　　

摘要

冷冻电镜（cryoEM）已成为解析生物大分子结构的关键技术，但传统方法需将分子从细胞环境中分离，导致其天然构象和互作信息丢失。本研究开发的AFM4cryoEM系统通过力敏感微流控悬臂，实现了飞升级（最低204 fL）样本的靶向提取、精准分配与玻璃化冷冻，为原位结构生物学研究开辟新途径。

1 引言

cryoEM技术虽在纯化样本结构解析中表现卓越，但细胞原位结构信息获取仍依赖冷冻电子断层扫描（cryo-ET），需对样品进行冷冻切片或聚焦离子束减薄。现有技术无法实现特定亚细胞组分的靶向提取与直接成像。本研究通过微流控AFM悬臂技术，将纳米操作与cryoEM样本制备结合，填补了这一技术空白。

2 系统设计

2.1 核心概念

AFM4cryoEM系统核心为带有微流通道的AFM悬臂，其通过实时力反馈控制穿刺细胞膜（图1）。悬臂尖端孔径1.5 μm，内部通道高度1 μm，刚度2 Nm^-1。系统在70%湿度环境中运行，TEM载网通过帕尔贴元件维持在露点温度以上，防止样本蒸发。

2.2 工作流程

流程分三阶段（图2）：

• A阶段：等离子处理的载网通过90°旋转机械臂装载至温控支架；

• B阶段：荧光显微镜定位目标后，悬臂穿刺细胞并施加800 mbar负压吸取胞质，再以1 bar正压将样本分配至载网；

• C阶段：载网经机械臂转移至液态乙烷中玻璃化冷冻。

3 结果与讨论

3.1 系统构建

系统集成倒置荧光显微镜、纳米级精度XY平台（分辨率100 nm）和线性电机驱动的冷冻 plunger（速度1.5 m/s）。铜制载网支架通过帕尔贴控温，湿度舱由LabVIEW程序全自动控制（图3）。

3.2 微流控悬臂特性

硅氮化物悬臂经辛基三氯硅烷疏水修饰，圆柱形尖端高5 μm，可减少堵塞（图4）。实验显示，1.5 μm孔径悬臂在2-4 bar压力下可分配2.9-10.5 pL液滴（图5），接触角40°时计算体积误差<5%。

3.3 生物样本验证

• 金颗粒与载铁蛋白（ApoF）：负染电镜显示样本完整性保持（图6）；

• 脂质体：105 nm囊泡结构未明显破裂，但冰层过厚影响成像对比度；

• 单细胞操作：力曲线显示核区穿刺需8 μm压入深度，边缘区域则因接触玻璃基底呈现陡峭斜率（图7）。

3.4 亚细胞活检

HeLa细胞胞质提取实验显示，450 fL内容物以2.5±1.9 fL/s流速被吸取（图9）。但分配后样本稀释11倍，且碳膜润湿性不足导致冰层过厚（>100 nm），仅边缘区域可见囊泡样结构。

3.5 飞升级单颗粒样本

烟草花叶病毒（TMV）分配实验实现204 fL级液滴制备（图10），电镜显示病毒颗粒保持300 nm长度特征，但冰层厚度限制三维重构（图11）。

4 结论

AFM4cryoEM系统首次实现单细胞飞升级样本的原位提取与cryoEM制备，突破传统技术体积限制。当前挑战在于改善液滴铺展以获取薄冰区，未来可通过优化载网亲水性或集成纳米流体通道解决。该技术为细胞器互作、病原体侵染等动态过程的结构研究提供全新工具。

5 实验方法

关键参数：

• 悬臂：SmartTip公司定制，弹簧系数2 Nm^-1；

• 细胞培养：HeLa mRFP-GFP-LC3细胞经饥饿诱导自噬体形成；

• 电镜：JEOL 3200-FSC在300 kV下成像，冰厚通过20 eV能量过滤计算。

（注：全文数据均来自原文实验，未添加主观推断）