顺式不饱和鞘脂支持鞘氨醇碱基缺陷型酵母生长但损害质膜完整性研究

这篇研究通过基因工程手段构建了鞘脂长链碱基（LCB）缺陷型酵母模型，首次实现了真核细胞鞘脂几乎全部由含顺式双键（8Z）的LCB构成。研究发现植物型不饱和LCB（如t18:1(8Z)和d18:2(4E,8E)）可被酵母代谢为神经酰胺（Cer）和复合鞘脂（IPC/MIPC/M(IP)2C），但会导致质膜通透性增加、脂质有序性降低以及质膜蛋白（如Pma1）定位异常。值得注意的是，这些细胞通过增强细胞壁（几丁质和甘露聚糖）合成来代偿质膜功能缺陷，为研究鞘脂结构与膜功能关系提供了独特模型。

　　

鞘脂长链碱基的结构多样性研究

鞘脂长链碱基（LCB）构成鞘脂分子的骨架结构，在不同真核生物中具有显著差异。酿酒酵母主要含有植物鞘氨醇（PHS）和二氢鞘氨醇（DHS），而动植物则产生结构更多样的LCB，包括含顺式（cis）或反式（trans）双键的变体。通过构建LCB合成缺陷型酵母（lcb2Δ lcb4Δ sur2Δ），研究发现外源添加植物型不饱和LCB可支持细胞生长。

植物型不饱和LCB的代谢特征

实验证实t18:1(8Z)（含C8顺式双键的4-羟基-8-鞘氨烯碱）和d18:2(4E,8E)（含C8反式双键的鞘氨二烯碱）能被酵母有效吸收并转化为神经酰胺（Cer）和复合鞘脂（IPC/MIPC/M(IP)₂C）。液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI MS/MS）分析显示，94%以上的Cer中LCB被成功替换。值得注意的是，SPH和d18:2(4E,8E)替换细胞中，含有C16/C18脂肪酸或非羟基化脂肪酸的Cer比例显著增加，但这些Cer变体难以进一步转化为复合鞘脂。

质膜完整性与细胞壁重塑

膜探针实验揭示不饱和LCB导致显著膜功能异常：

1. 膜通透性：t18:1(8Z)和d18:2(4E,8E)细胞对罗丹明6G的摄取量分别比PHS和SPH细胞增加2.3倍和1.8倍

2. 脂质有序性：di-4-ANEPPDHQ染色显示绿色/红色荧光比值下降，表明膜脂质排列有序性降低

3. 细胞壁补偿：zymolyase敏感性实验显示t18:1(8Z)细胞抗性增强，钙荧光白（CFW）和ConA-FITC染色显示几丁质和甘露聚糖含量分别增加40%和35%

膜微区蛋白的异常分布

荧光标记技术揭示：

• 含顺式双键的t18:1(8Z)导致eisosome数量增加50%（Pil1-yeGFP斑点增多）

• Pma1-yeGFP在t18:1(8Z)和d18:2(4E,8E)细胞中出现液泡内积累（定位异常率达65%）

• 内质网蛋白Pho88-yeGFP分布未受影响

进化与生物技术启示

该研究首次建立鞘脂几乎全部由顺式双键LCB构成的真核细胞模型，为理解以下问题提供新视角：

1. 鞘脂结构多样性在物种适应性进化中的作用

2. 顺式双键对脂筏微区形成的调控机制

3. 膜脂质-固醇分子互作的特异性

   在应用层面，该技术平台可用于：

   • 定向生物合成特殊结构鞘脂

   • 病原真菌膜生物学研究

   • 新型抗真菌靶点开发

技术方法创新点

研究采用多重技术验证：

1. 四环素调控系统（tet-LIP1）证实Cer合成对细胞存活的关键性

2. 奥瑞菌素A（AbA）抑制实验揭示IPC合成通路的重要性

3. 流式细胞术定量膜秩序参数（GP值）

4. 随机孢子分析构建多重突变株

这些发现为膜脂质结构与功能研究提供了重要模型，也为开发基于鞘脂结构调控的 therapeutic 策略奠定基础。