基于16S rRNA的土壤微生物组分析，对Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies和Illumina三种测序平台进行了比较评估

《Frontiers in Microbiology》：Comparative evaluation of sequencing platforms: Pacific Biosciences, Oxford Nanopore Technologies, and Illumina for 16S rRNA-based soil microbiome profiling

土壤微生物组测序技术比较：PacBio与ONT在多样性评估中表现相当，PacBio对低丰度物种检测更优，Illumina V4区域分析存在局限性。

　　土壤微生物组的分析在理解微生物多样性及其在生态系统功能和农业生产中的作用方面具有至关重要的意义。随着高通量测序技术的不断发展，特别是太平洋生物公司（PacBio）和牛津纳米孔技术（ONT）提供的长读长测序能力，微生物群落的研究正变得更加精确和全面。本研究通过比较使用Illumina（V4和V3–V4区域）、PacBio（全长和修剪后的V3–V4/V4区域）以及ONT（全长）对土壤微生物组进行16S rRNA基因测序的结果，评估了不同技术在细菌多样性分析中的表现。我们对三种不同的土壤类型进行了分析，并应用了标准化的生物信息学流程以确保结果的一致性。为了保证可比性，所有平台的测序深度被统一为每样本10,000、20,000、25,000和35,000条读段。研究结果表明，ONT和PacBio在细菌多样性评估方面表现出高度一致性，其中PacBio在检测低丰度微生物方面略具优势。尽管ONT的测序准确性相对较低，但其在识别高丰度微生物时仍能提供可靠的结果，这表明其固有的测序错误并未显著影响对主要微生物类群的解读。此外，无论采用哪种测序技术及选择哪种目标区域（全长16S rRNA基因或其特定区域），微生物群落分析均能清晰地将样本按土壤类型进行聚类，唯一的例外是V4区域，其中未观察到土壤类型的聚类（p=0.79）。这些结果为测序平台的性能评估提供了全面的视角。

土壤微生物组的复杂性不仅体现在其高多样性上，还表现在其在不同环境条件下的动态变化上。传统方法如培养法和基于PCR的技术在微生物研究中存在诸多局限，例如难以全面反映微生物多样性、对特定微生物的检测能力有限以及操作流程繁琐等。相比之下，高通量测序技术通过并行分析数万至数百万条DNA序列，能够更有效地识别丰富和稀有微生物类群，并为评估功能潜力和研究微生物群落的空间与时间动态提供了可能性。同时，这些技术还能显著降低时间和成本，使得大规模的土壤生态系统分析成为可能，这对研究生物地球化学循环、植物与微生物的相互作用以及环境响应至关重要。因此，研究者们越来越重视高通量测序技术在土壤微生物组分析中的应用。

16S rRNA基因测序是目前用于微生物群落分类和分析其特征的一种可靠且高效的方法。第三代测序技术，如PacBio和ONT，因其能够生成全长的16S rRNA序列，从而实现更精细的分类分辨率而被认为优于传统的Illumina和Sanger测序。传统短读长测序技术（如Illumina）通常针对高变异性区域（例如V3–V4），这可能导致分类上的不确定性。而长读长测序技术则克服了这一限制，提升了物种级别的识别能力。PacBio平台采用环形共识测序（CCS）模型，能够完整覆盖整个16S rRNA基因序列，提供超过99.9%的高分辨率物种识别能力。ONT平台虽然在早期由于较高的错误率而受到质疑，但近年来，随着新型试剂盒、双读取头的流细胞（如本研究中使用的R10.4.1流细胞）以及更先进的碱基调用算法的出现，其碱基准确性已提升至99%以上。此外，专门为全长16S rRNA序列设计的算法，如Emu，能有效减少假阳性与假阴性，从而降低错误率。这些技术进步表明，ONT平台在准确性和大规模研究方面展现出巨大的潜力。

在本研究中，我们对PacBio、ONT和Illumina三种平台的性能进行了系统评估。通过分析不同测序深度（10,000、20,000、25,000和35,000读段）下的α和β多样性指标，以及每种平台的分类分辨率，我们旨在揭示每种技术在土壤微生物组研究中的相对优势与不足。结果显示，随着测序深度的增加，PacBio和ONT在物种识别数量上都有显著提升。例如，在10,000读段时，PacBio识别了348个物种，而ONT识别了267个物种；在35,000读段时，PacBio识别了1,23个物种，ONT则识别了1,3个物种。值得注意的是，当测序深度达到35,000时，PacBio和ONT的物种识别数量趋于稳定，这表明此时已获得足够的分类覆盖。同时，两种技术在分类未识别的读段比例上均保持较低水平，分别仅为0.12%和0.04%，进一步验证了其在识别物种方面的可靠性。

在比较PacBio和ONT的分类重叠情况时，我们发现大约一半的总物种被两种技术共同识别，其中重叠比例在10,000读段时为55.7%，随着读段数的增加，重叠比例略有上升，达到57.6%。然而，PacBio在识别独特物种方面表现出更高的敏感性，其在10,000读段时比ONT多出20.5%，在20,000读段时多出13.7%，在25,000读段时多出16%，在35,000读段时则为13.2%。这表明，尽管ONT的分类准确性可能稍逊于PacBio，但其在识别主要微生物类群方面仍然表现良好。此外，PacBio在低读段数下展现出更高的效率，这可能与其长读长和高准确性的特点有关，即通过多次同一DNA分子的测序，有效减少了随机错误的影响。

与ONT和PacBio相比，Illumina平台在检测低丰度微生物方面表现相对较弱。在对Illumina和ONT进行比较分析时，我们发现ONT能够识别更多的细菌类群，且其分类结果在不同读段数下保持稳定。而Illumina仅识别了232个细菌属，相比之下，ONT识别了545个属。此外，Illumina的分类结果倾向于某些特定的细菌类群，如放线菌门（Actinomycetes），而ONT则更广泛地检测到芽孢杆菌门（Bacilli）相关的微生物。这一差异可能与两种平台的测序策略和PCR引物选择有关。Illumina平台通常使用V3–V4区域的引物进行扩增，这可能导致某些微生物类群被遗漏。而ONT和PacBio则能够覆盖整个16S rRNA基因序列，从而提供更全面的分类信息。

在对PacBio与Illumina的V3–V4和V4区域进行比较分析时，我们发现PacBio在识别物种多样性方面具有显著优势。当将PacBio的读段修剪至与Illumina相同的V3–V4和V4区域时，其识别的物种数量仍然高于Illumina，特别是在低读段数的情况下。此外，PacBio的分类结果在不同读段数下表现出更高的稳定性，这可能与其长读长和高准确性有关。而Illumina由于读段长度限制，无法实现全长16S rRNA基因的测序，因此在识别低丰度微生物方面存在一定的局限性。这表明，在进行微生物群落分析时，选择全长测序技术可能更有利于全面了解土壤微生物的组成和多样性。

我们还观察到，不同测序技术在识别特定微生物类群时存在一定的偏好性。例如，ONT在识别某些特定属如Blastococcus和Sphingomicrobium方面表现出更高的灵敏度，而PacBio则在检测低丰度物种方面更具优势。这些差异可能与测序平台的碱基准确性、错误率以及生物信息学处理流程有关。ONT的高错误率可能导致一些低丰度物种被误判为测序误差，而PacBio的高准确性和较低的过滤率则有助于保留更多的稀有物种信息。此外，土壤微生物群落中高GC含量的微生物可能在ONT数据集中受到系统性低估，而PacBio则相对较少受到这种偏差的影响，从而在复杂环境中更好地恢复稀有物种。

在β多样性分析中，我们发现样本在不同测序技术下形成了两个不同的聚类，这表明每种技术对微生物群落的检测具有独特的贡献。然而，通过Procrustes检验，我们发现ONT和PacBio在不同测序深度下所识别的微生物群落结构具有显著相似性，这表明尽管它们在技术细节上有所不同，但总体上能够提供可靠的分类结果。此外，无论采用哪种测序技术，样本在土壤类型上的聚类趋势都较为一致，只有在分析V4区域时未观察到显著的聚类（p=0.79）。这一结果提示，V4区域的测序可能在某些情况下无法有效区分土壤类型，这可能与其特定的高变异性区域特性有关。

在研究中，我们还发现不同测序平台在分类过程中存在一定的偏差。例如，Illumina平台的分类结果倾向于某些特定的微生物类群，而ONT和PacBio则能更全面地覆盖多种微生物。这种偏差可能影响不同研究之间的结果可比性，因此在选择测序平台时需要综合考虑其优缺点。此外，研究还指出，当前的长读长分类工具，如Emu，缺乏明确的嵌合体检测模块，这可能影响复杂微生物群落的数据质量。因此，开发适用于长读长测序的嵌合体检测算法，对于提高分类准确性具有重要意义。

本研究的结果表明，尽管不同测序平台在技术特性上存在差异，但它们在检测土壤微生物多样性方面均表现出一定的可靠性。选择合适的测序深度和目标区域是实现准确分类的关键因素。例如，Illumina的V3–V4区域虽然能提供较高的分类分辨率，但在某些情况下可能低估低丰度微生物的多样性。而PacBio和ONT的全长测序技术则能够更全面地覆盖微生物群落，特别是在低读段数下，PacBio在识别低丰度物种方面表现更为出色。这些发现为未来土壤微生物组研究提供了重要的参考，尤其是在选择测序策略和优化分类流程方面。

此外，本研究强调了在进行微生物组分析时，需要结合多种技术的优势。例如，PacBio和ONT在识别低丰度物种和全长序列方面表现优异，而Illumina则在处理大规模数据和提供快速分析方面具有独特优势。因此，根据研究目标和土壤类型，选择合适的测序技术对于获得准确的微生物多样性数据至关重要。同时，研究还指出，未来的研究应进一步探索不同16S rRNA区域和引物组合对微生物群落分析的影响，以优化分类策略并提高研究的可靠性。通过综合应用多种测序技术和优化生物信息学流程，可以更全面地揭示土壤微生物的复杂性和动态变化，为可持续农业和生态系统的保护提供科学依据。