单细胞转录组分析揭示了结核分枝杆菌感染的C3HeB/FeJ小鼠肺部坏死性肉芽肿病变的新特征

《Frontiers in Immunology》：Single-cell transcriptomic profiling reveals a novel signature of necrotizing granulomatous lesions in the lungs of Mycobacterium tuberculosis-infected C3HeB/FeJ mice

结核病小鼠模型单细胞转录组分析揭示坏死性肉芽肿免疫细胞组成及泡沫巨噬细胞新功能特征。

　　结核病（Tuberculosis, TB）是一种由结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*）引起的慢性传染病，全球范围内影响着数亿人，并且仍然是导致死亡的主要原因之一。随着研究的深入，科学家们逐渐认识到结核病的病理机制不仅涉及细菌本身的特性，还与宿主免疫系统的复杂反应密切相关。特别是，结核病在肺部形成的坏死性肉芽肿病变（necrotizing granulomas）被认为是疾病进展的关键标志之一。这些肉芽肿由多种免疫细胞组成，包括吞噬细胞、T细胞、自然杀伤细胞（NK cells）、B细胞、树突状细胞（DCs）等，它们在维持免疫平衡和对抗病原体方面发挥着重要作用。

为了更全面地理解坏死性肉芽肿的免疫环境，研究团队采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术，对感染结核分枝杆菌的C3HeB/FeJ小鼠肺部坏死性肉芽肿进行了深入分析。C3HeB/FeJ小鼠是一种常用于研究结核病的实验模型，其感染后形成的肉芽肿在病理特征上与人类结核病高度相似。通过scRNA-seq，研究人员成功鉴定了11种主要的细胞类型，并对其转录组特征进行了系统分析。其中，吞噬细胞如中性粒细胞和巨噬细胞、T细胞、NK细胞、B细胞以及树突状细胞（包括常规树突状细胞和浆细胞样树突状细胞）均被识别出来。这些细胞在坏死性肉芽肿中的分布和功能状态，为揭示结核病的免疫机制提供了新的视角。

在T细胞亚群中，研究人员特别关注了γδ T细胞，这是一种非经典的T细胞类型，通常在结核病的免疫反应中扮演重要角色。通过分析发现，这些γδ T细胞中表达*Pdcd1*基因，该基因编码程序性细胞死亡蛋白1（PD-1），这是一种在免疫调节中起关键作用的检查点分子。PD-1的表达可能意味着这些γδ T细胞在结核病的病理过程中具有双重功能，既可能参与免疫防御，也可能促进免疫损伤。此外，研究还发现了一种独特的T细胞亚群，其同时表达T细胞受体γ链（*Tcrg*）和NK细胞受体（*Klrd1*），这提示该细胞可能具有类似先天性淋巴细胞（innaate lymphoid cells, ILCs）的功能，可能在结核病的免疫应答中起到特殊作用。

巨噬细胞是坏死性肉芽肿中最为关键的细胞类型之一，它们不仅负责吞噬病原体，还在维持肉芽肿结构和功能方面发挥核心作用。研究发现，*Plin2*基因在坏死性肉芽肿中的巨噬细胞中显著上调，这一特征与脂肪吞噬性巨噬细胞（foamy macrophages）密切相关。进一步分析表明，这些*Plin2*高表达的巨噬细胞具有独特的转录组特征，其基因表达模式与典型的脂肪吞噬性巨噬细胞一致。此外，研究人员还发现，*Plin2*高表达的巨噬细胞是*Ifnb1*和*Cxcl1*的主要来源，这两个基因分别与I型干扰素信号通路和中性粒细胞招募有关。这些发现表明，*Plin2*高表达的巨噬细胞可能在结核病的免疫反应中起到关键作用，通过促进炎症反应和招募中性粒细胞，参与疾病的进展。

为了进一步探索*Plin2*高表达巨噬细胞的功能特性，研究团队鉴定了其新的分子标志物，包括*Flrt2*、*Hyal1*和*Mmp13*。这些基因的表达在坏死性肉芽肿的外周区域显著富集，且其蛋白产物与*Plin2*共定位。其中，*Flrt2*被认为参与巨噬细胞的分化过程，并可能通过激活Akt/mTOR信号通路影响巨噬细胞的功能。*Hyal1*是一种溶酶体中的透明质酸酶，可能通过降解细胞外基质促进中性粒细胞的迁移。而*Mmp13*则与胶原蛋白重塑有关，可能在肉芽肿结构的形成和维持中发挥作用。这些分子标志物的发现不仅有助于更准确地识别*Plin2*高表达巨噬细胞，也为未来开发针对这些细胞的诊断工具和治疗策略提供了理论依据。

此外，研究还揭示了浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）在坏死性肉芽肿中的免疫调节作用。pDCs在抗病毒免疫中起着重要作用，通过大量分泌I型干扰素（type I IFNs）来激活免疫反应。然而，在结核病的背景下，研究发现pDCs并不主要表达*Ifnb1*，而是更多地表达其他免疫抑制相关基因，如*Il34*和*Kmo*。*Il34*是一种抗炎性细胞因子，能够调节促炎性细胞因子的表达并促进巨噬细胞向抗炎表型极化。*Kmo*则编码一种催化色氨酸代谢的酶，其产物可能通过氧化应激诱导细胞损伤和凋亡。这些结果表明，pDCs在结核病中的作用可能与它们的免疫抑制功能相关，而非传统的抗病毒角色。

在巨噬细胞的极化状态方面，研究发现*Plin2*高表达的巨噬细胞同时表达*Nos2*和*Arg1*，这两种基因分别代表促炎性和抗炎性巨噬细胞的典型标志物。这一发现表明，*Plin2*高表达的巨噬细胞可能处于一种独特的极化状态，既表现出促炎性特征，又具有抗炎性倾向。这种双重极化可能反映了巨噬细胞在应对结核分枝杆菌感染时的动态变化，也可能与其在肉芽肿内的功能多样性有关。进一步的分析显示，这一极化状态在*Sp140*基因敲除（KO）小鼠的肺部巨噬细胞中也有所体现，表明该极化状态可能是结核病感染过程中宿主免疫系统的一种普遍反应。

研究还发现，*Plin2*高表达的巨噬细胞在坏死性肉芽肿的外周区域聚集，这与I型干扰素信号通路和中性粒细胞招募的增强密切相关。这一现象可能与肉芽肿的坏死核心形成有关，因为中性粒细胞及其细胞外陷阱（NETs）在坏死区域的积累是结核病的一个显著特征。研究团队通过免疫组化和免疫荧光显微镜技术验证了这些分子标志物在组织中的分布，进一步支持了它们在肉芽肿形成和维持中的作用。

总体而言，这项研究利用单细胞测序技术对结核病坏死性肉芽肿的免疫景观进行了全面解析，揭示了巨噬细胞在其中的新型极化状态及其潜在的免疫调控功能。此外，还发现了新的分子标志物，为理解结核病的发病机制提供了新的线索。这些发现不仅有助于揭示结核病的复杂免疫网络，也为开发新的诊断方法和针对宿主免疫反应的治疗策略奠定了基础。未来的研究可以进一步探讨这些细胞类型和分子标志物在结核病不同阶段的作用，以及它们如何影响疾病的进展和治疗反应。