重组SADS-CoV作为猪流行性腹泻疫苗开发的载体

《Frontiers in Immunology》：Recombinant SADS-CoV as a vector for porcine epidemic diarrhea vaccine development

SADS-CoV作为新型疫苗载体，通过敲除NS3a基因并表达PEDV COE+S1D抗原及M细胞靶向肽Co1和树突状细胞靶向肽DCpep，构建了四株重组病毒。实验证明这些病毒在Vero细胞中稳定复制并高效表达抗原蛋白，且双靶向肽病毒（Co1-DCpep）在怀孕母猪免疫后，其仔猪在PEDV挑战中表现出最低腹泻评分、最快恢复速度和最少的病毒载量，同时诱导了更强的DC和T细胞免疫应答。该研究建立了SADS-CoV疫苗开发平台，为克服传统疫苗缺陷提供了新思路。

　　SADS-CoV，一种新型的猪肠道冠状病毒，因其在5日龄以下小猪中可引起腹泻而在更大龄猪中表现出较低的致病性，这为它作为疫苗载体的开发提供了可能性。该病毒在实验室条件下表现出良好的生物安全性，使其成为开发针对猪腹泻病病毒（如PEDV）疫苗的有吸引力的选择。在本研究中，科学家们利用基因工程技术构建了表达PEDV保护性抗原的四种减毒重组SADS-CoV株，并评估了它们的生物学特性和免疫原性。

研究过程中，首先通过Gibson组装技术将SADS-CoV的完整基因组克隆到人工细菌染色体（BAC）载体中，构建了SADS-CoV的感染性克隆。随后，使用Red/phi重组技术对克隆进行进一步的基因修饰，包括删除NS3a辅助蛋白基因，并插入表达PEDV抗原的基因片段，以及针对M细胞和树突状细胞（DCs）的靶向肽Co1和DCpep。这些靶向肽有助于增强抗原的递送效率和免疫反应的启动，从而提高疫苗的保护效果。

在构建过程中，研究人员发现重组病毒在Vero细胞中表现出与野生型病毒相似的增殖特征，并且在连续传代至第20代时，其细胞病变效应依然稳定，且外源基因序列未发生变异。这表明，通过SADS-CoV载体表达的外源蛋白具有良好的稳定性和表达能力，这为后续的免疫评估提供了可靠的基础。

为了评估这些重组病毒的免疫原性，研究人员对怀孕母猪进行了接种，并在分娩时收集外周血样，通过流式细胞术分析了DC亚群（如CD11c和CD80）和T细胞亚群（如CD3+CD4+和CD3+CD8+）的比例。结果显示，接种含有Co1或DCpep靶向肽的重组病毒的母猪表现出更高的DC和T细胞亚群比例，表明这些病毒能够有效激活免疫系统。此外，通过ELISA检测发现，接种组的母猪和其后代猪仔体内出现了针对PEDV S蛋白的IgG和IgA抗体，进一步验证了疫苗的免疫刺激能力。

在疫苗的保护效果评估方面，研究人员将接种过的母猪后代猪仔暴露于PEDV感染，观察其临床症状和体重变化。结果显示，所有接种重组病毒的组别在感染后的腹泻评分和体重损失方面均优于未接种组，尤其是同时含有Co1和DCpep靶向肽的重组病毒表现出最显著的保护效果。这表明，这种病毒载体与靶向肽的结合能够有效降低PEDV对猪仔的感染影响，加速其恢复过程，并减少肠道组织损伤。

进一步的组织病理学分析显示，接种组的猪仔肠道组织损伤程度明显低于未接种组，特别是含有双靶向肽的重组病毒组表现出更轻的肠道病变。免疫组化检测也支持了这一结论，显示在这些组别中，SADS-CoV抗原的表达水平较低，而PEDV抗原的表达则更有效，这说明疫苗在体内能够成功表达并激活免疫应答。

研究还指出，尽管SADS-CoV作为载体表现出良好的安全性，但在实际应用中仍需考虑其与免疫途径的匹配性。例如，单靶向肽的重组病毒在激活T细胞方面的效果不如双靶向肽，这可能与免疫递送方式有关。因此，未来的研究可以探索通过不同的免疫途径（如口服或鼻腔）来进一步优化疫苗的免疫效果。

此外，与现有的灭活疫苗和减毒活疫苗相比，SADS-CoV载体疫苗具有成本低、安全性高和增强黏膜免疫反应的优势。这些特点使其在控制PEDV和其他影响猪健康的病毒方面具有广阔的应用前景。通过结合SADS-CoV的复制特性与黏膜靶向肽，研究团队开发了一种新的疫苗策略，不仅有助于提高疫苗的保护效果，还为未来的多价疫苗和自佐剂疫苗的开发提供了基础。

在实验方法方面，研究采用了多种技术手段，包括RT-PCR、Gibson组装、Red/phi重组、流式细胞术和ELISA等，以确保病毒的正确构建和疫苗的免疫评估。这些技术的应用不仅提高了研究的精确度，也为未来类似研究提供了可借鉴的方法论。

总体而言，本研究成功构建了一种基于SADS-CoV的重组病毒疫苗，该疫苗能够有效激活母猪的免疫系统，并通过母源抗体保护其后代免受PEDV感染。这些发现不仅为猪腹泻病的防控提供了新的思路，也为利用SADS-CoV作为疫苗载体进行其他病毒疫苗的研发奠定了基础。未来的研究可以进一步优化疫苗设计，探索更有效的免疫途径，并评估其在更大规模应用中的安全性和有效性。