基于突变E蛋白ELISA技术实现鸟类与马匹中西尼罗河病毒、乌苏图病毒和蜱传脑炎病毒抗体的血清学鉴别

本研究针对西尼罗河病毒(WNV)、乌苏图病毒(USUV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)抗体交叉反应难题，开发了基于融合环结构域突变E蛋白(Equad蛋白)的ELISA检测技术。通过建立12种检测方案，在169份鸭鹅血清、101份鸡血清和136份马血清中实现了WNV/USUV/TBEV抗体的高灵敏度(80-100%)和特异性(87-100%)鉴别，尤其通过异源抗原预吸收步骤显著提升WNV与USUV的区分能力。该技术突破传统病毒中和试验(VNT)对生物安全三级实验室的依赖，为动物疫病监测和兽医诊断提供高效解决方案。

在全球气候变化背景下，蚊媒和蜱传 flavivirus 的传播范围持续扩大，西尼罗河病毒(WNV)、乌苏图病毒(USUV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)这三种结构相似的 orthoflavivirus 在欧洲多地形成共循环。这类病毒感染可导致从轻微症状到致死性后果的疾病谱，其中鸟类作为 WNV 和 USUV 的主要储存宿主，马匹作为重要哨兵动物，在流行病学监测中具有关键价值。然而，现有血清学检测面临严峻挑战——传统酶联免疫吸附试验(ELISA)因病毒E蛋白高度保守的融合环(FL)结构域引发抗体交叉反应，而金标准的病毒中和试验(VNT)又存在耗时长(需数日)、成本高且必须在生物安全三级(BSL-3)实验室操作的局限性。

针对这一诊断困境，德国联邦动物健康研究所(Friedrich-Loeffler Institut)联合弗劳恩霍夫细胞治疗与免疫学研究所的研究团队在《Scientific Reports》发表创新性解决方案。研究人员基于前期发现，采用在FL结构域引入四个点突变的重组E蛋白(Equad蛋白)，建立了可区分WNV、USUV和TBEV抗体的新型ELISA检测体系。研究团队首先通过果蝇S2细胞表达系统制备了三种病毒的突变E蛋白，随后优化检测条件，针对不同动物物种(鸭鹅/鸡/马)分别建立12种检测方案，并创新性引入异源抗原预吸收步骤来增强区分度。

关键技术方法包括：(1)使用ID Screen竞争ELISA和VNT对407份动物血清(含169份鸭鹅血清、101份鸡血清和136份马血清)进行预筛选；(2)建立基于Equad蛋白的间接ELISA，优化血清稀释度(1:10-1:100)和孵育条件；(3)针对WNV/USUV交叉反应开发预吸收ELISA，使用20μg/mL USUV Equad蛋白或16μg/mL WNV Equad蛋白进行预孵育；(4)采用ROC曲线分析确定各方案最佳cut-off值。

鸭鹅血清检测结果

WNV Equad ELISA达到100%灵敏度和98.55%特异性(AUROC=0.995)，预吸收方案使特异性提升至100%。USUV检测中，预吸收将特异性从88.82%提升至98.11%(AUROC=0.9976)，8份USUV阳性血清的假阳性率从25%降至0。TBEV Equad ELISA表现优异(灵敏度91.3%，特异性100%)，23份阳性血清中仅4份低VNT滴度(1:15-1:40)样本信号较弱。

鸡血清检测结果

WNV Equad ELISA实现100%灵敏度和98.78%特异性(AUROC>0.997)。TBEV检测因鸡群中USUV阳性样本缺乏，仅评估WNV/TBEV区分能力，灵敏度80.43%、特异性89.09%(AUROC=0.9312)。

马血清检测结果

WNV预吸收方案将特异性从87.36%提升至100%，9份USUV阳性样本假阳性率从77.78%降至0。USUV预吸收ELISA达到完美区分(AUROC=1.0)。TBEV检测因属不同血清群，无需预吸收即获100%灵敏度和96.97%特异性。

这项研究通过分子设计解决了 flavivirus 血清学诊断的核心难题。Equad蛋白通过破坏FL保守表位，有效减少了WNV/USUV/TBEV抗体的交叉反应，结合预吸收策略使区分度达到近乎完美。相较于传统VNT，新方法将检测时间从数天缩短至1-2天，且无需BSL-3设施，特别适合大规模动物疫病监测。研究不仅证实该技术在马匹中的适用性，更首次在禽类血清中验证其效能，为野生动物疫病防控提供了重要工具。值得注意的是，该方法对疫苗接种马匹会产生阳性信号，强调在流行病学研究中需结合疫苗接种史进行结果判读。未来研究可扩展至更多野生鸟类物种，并探索在动物园鸟类监测中的应用价值。这项技术突破为应对气候变化下虫媒病毒传播范围扩大的挑战提供了及时、高效的诊断武器。