Oatk：基于同步k-mer的复杂植物细胞器基因组从头组装工具的开发与应用

研究人员针对植物细胞器基因组(尤其是含复杂重复序列的线粒体基因组)组装难题，开发了新型工具Oatk。该工具通过同步k-mer(syncmer)组装器快速构建稀疏图，结合HMM基因数据库精准识别序列，创新性地利用覆盖度优化路径选择，成功完成195种植物质体(plastome)和线粒体基因组(mitogenome)组装，揭示了结构异质性、DNA转移等进化特征，为植物系统发育和功能研究提供了高效解决方案。成果发表于《Genome Biology》。

　　

植物细胞器基因组是研究光合作用与呼吸作用的关键载体，其独特的进化历程导致质体(plastid)和线粒体(mitochondrion)基因组呈现高度动态性——从基因丢失、水平转移(HGT)到分子内重组，这些特性使得传统组装工具难以准确解析其复杂结构。尤其植物线粒体基因组大小差异可达200倍，且普遍存在长重复序列，导致现有方法如MITObim、GetOrganelle等在计算效率、重复序列解析和跨物种适用性方面存在显著局限。

剑桥大学(University of Cambridge)和威康桑格研究所(Wellcome Sanger Institute)的Chenxi Zhou等研究人员开发了Oatk工具包，通过三个核心模块突破技术瓶颈：syncasm组装器利用k=1001的同步k-mer(syncmer)构建稀疏de Bruijn图，较传统方法提升50倍压缩效率；hmmannot模块整合130个质体和81个线粒体HMM基因模型实现精准序列分类；pathfinder模块基于覆盖度优化路径选择，支持多构象基因组输出。研究团队应用该工具成功完成195种陆地植物(含24种单子叶植物、154种真双子叶植物和17种苔藓)的细胞器基因组组装，相关成果发表于《Genome Biology》。

关键技术包括：(1)采用PacBio HiFi长读长数据(平均读长15-20 kb)，通过同步k-mer稀疏化处理实现高效组装；(2)建立胚胎植物(Embryophyta)特异性HMM基因数据库，覆盖NADH dehydrogenase等保守基因；(3)基于GraphAligner的读长图谱分析验证结构异质性；(4)利用NUCmer进行序列比对识别质体-线粒体DNA转移事件。

组装性能比较

对比MBG、PMAT等工具，Oatk在195个物种中实现100%的质体基因组和85.6%的线粒体基因组环化组装，其中31个线粒体呈现多环状结构。同步k-mer策略使syncasm较MBG减少6个组装失败案例，pathfinder的图解析成功率显著高于GetOrganelle(如苔藓质体IR序列误判率降低92%)。

质体基因组结构特征

182个物种呈现典型四分区结构(LSC-IRa-SSC-IRb)，13个豆科植物缺失IR区域。研究发现Poales物种通过SSC序列向IR区转移导致基因组扩张(最大233 kb)，如Calluna vulgaris质体含嵌套重复形成复杂异构体(图2c)。通过HiFi读长映射证实所有测试物种均存在50:50比例的"flip-flop"重组异构体(图2f)，首次在组装图中直接观测到IR区小尺度异质性(图2h)。

线粒体基因组多样性

136个物种为单环状结构，31个呈多环状(如Galeopsis tetrahit含10个环状分子)，28个含线性组分。Alnus glutinosa线粒体末端环状结构(图3f)通过读长覆盖度分析验证，166个>1 kb重复序列介导的结构异质性显示双向重组特征(图3i)。Carex laevigata以2.7 Mb成为最大组装基因组，而苔藓Thuidium tamariscinum仅103 kb。

细胞器间DNA转移

144个物种中共发现578个转移序列(总计1.57 Mb)，其中98.4%为质体向线粒体转移。psaA基因系统发育分析(图4d)显示19对旁系同源基因互为最近邻，线粒体拷贝进化距离显著大于质体原型(p=1.007×10^-5)，证实转移是持续发生的进化过程。

该研究创建的Oatk工具集首次实现复杂植物细胞器基因组的快速精准组装，其同步k-mer策略为高重复基因组分析提供新范式。发现的IR边界迁移、动态异质性和跨细胞器DNA转移现象，为理解植物基因组进化机制提供了分子证据。研究者公开了涵盖多个门类的HMM数据库(OatkDB)，其模块化设计支持扩展到其他真核生物。未来结合ONT超长读长有望解析更大规模的结构变异，而组装图的直接分析将推动从"单一序列"到"图基因组"的范式转变。