环境DNA技术在鲸类性别鉴定中的应用：超越物种检测的海洋生物学突破

这篇研究创新性地利用环境DNA(eDNA)技术，通过采集鲸类尾迹水样(flukeprint)，应用ZFX/ZFY基因标记进行性别鉴定。研究对比了虎鲸(Orcinus orca)和座头鲸(Megaptera novaeangliae)的性别鉴定准确率，发现座头鲸样本匹配率达100%，而虎鲸因群体结构导致54%匹配率。该技术为替代侵入性活检提供了新思路，对大型鲸类(Balaenoptera spp.)等数据匮乏物种的性别鉴定具有重要应用价值。

　　

海洋生态系统中的性别鉴定革命

ABSTRACT

随着人类活动对海洋生态系统压力的加剧，对濒危物种的认知需求日益迫切。本研究突破性地将环境DNA(eDNA)技术应用于鲸类性别鉴定领域，通过采集虎鲸(n=67)和座头鲸(n=18)的尾迹水样(flukeprint)，采用常规PCR技术分析ZFX/ZFY基因扩增情况。结果显示虎鲸样本的ZFX/ZFY PCR扩增成功率(53%)略高于座头鲸(44%)，但受其紧密社会结构影响，仅54%样本与已知性别匹配。相比之下，座头鲸样本全部准确匹配已知性别(100%)。这些发现表明eDNA技术有望取代侵入性活检进行性别鉴定，但需针对不同物种优化采样方案和ZFX/ZFY扩增方法。

1 Introduction

东北太平洋水域以其丰富的海洋生物多样性著称，特别是海洋哺乳动物资源。虎鲸和座头鲸作为该区域常见鲸种，正面临船只干扰、海洋污染和猎物减少等多重威胁。传统性别鉴定方法存在局限性：虎鲸依赖形态学特征(成年雄性具有更大的胸鳍、尾鳍和背鳍)，而座头鲸缺乏明显两性异形特征。虽然皮肤活检、粪便和喷气样本可用于性别鉴定，但采样技术难度大。本研究采用Konrad等开发的针对降解DNA的ZFX/ZFY标记(94-bp片段)，首次将核标记应用于鲸类eDNA研究，填补了该领域空白。

2 Materials and Methods

2.1 样本采集与过滤

研究于2023年2月至2024年2月在加拿大不列颠哥伦比亚省沿海水域进行。使用3.75L无菌水壶采集虎鲸和座头鲸尾迹水样，采样体积从初始1L逐步增加至2-2.5L以提高检出率。样本分为即时过滤(n=22，使用0.45μM自保存滤器)和延迟过滤(n=63，-20°C冷冻保存)两组。所有操作均遵循严格去污染流程，采样时记录个体数量、身份识别、距离等参数。

2.2 DNA提取与物种检测

采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit进行DNA提取，使用物种特异性引物进行qPCR检测。虎鲸引物产生139bp产物(退火温度58°C)，座头鲸引物产生76bp产物(退火温度56°C)。所有实验均设置阴性对照(提取空白和扩增空白)。

2.3 性别鉴定

采用Konrad等开发的鲸类性别鉴定方法，针对ZFX/ZFY基因设计含纳米足序列的引物(CetSex94-nanofoot-F/R)。PCR产物经TaqI-v2限制性内切酶消化后，通过2.5%琼脂糖凝胶电泳判定性别：雌性为~90bp单条带，雄性为~90bp和~160bp双条带。

2.4 数据可视化与统计分析

采用广义加性模型(GAMs)分析采样体积、目标物种和个体数量对PCR成功率及性别匹配率的影响。所有分析在R(version 4.3.2)中完成。

3 Results

3.1 物种DNA检测

67份虎鲸样本中56份(85%)、18份座头鲸样本全部(100%)成功检出目标物种DNA。虎鲸阳性样本中16份来自南方居留型，40份来自Bigg's型(过客型)。座头鲸样本主要采集成体，72%个体性别未知。

3.2 性别鉴定

虎鲸样本中54%成功扩增ZFX基因，54%与已知性别匹配。近距离(<1体长)采集样本均未正确匹配性别。远距离(>1体长)样本中49%扩增成功，75%正确匹配性别。座头鲸样本44%扩增成功，全部匹配已知性别。GAM模型显示鲸群数量和DNA浓度对扩增成功率有微弱正向影响。

4 Discussion

本研究首次证实eDNA技术可用于鲸类性别鉴定，但效果因物种而异。座头鲸的高匹配率(100%)得益于其独居或成对活动的习性，而虎鲸的低匹配率(54%)可能源于群体活动中DNA混合。技术层面，核DNA在环境中的快速降解、采样体积限制等因素影响了扩增效率。未来可通过增加采样体积、开发qPCR标记或采用新一代测序(NGS)技术提高成功率。该方法特别适用于缺乏明显两性特征的稀有鲸种(如蓝鲸Balaenoptera musculus)，为种群性别比例研究提供了非侵入性解决方案。

这项研究将eDNA技术的应用从物种检测扩展到个体水平信息获取，为海洋哺乳动物保护管理提供了重要工具。通过优化采样方案和分析方法，eDNA性别鉴定有望成为鲸类生态研究和保护实践中的常规手段。