实时成像荧光报告平台：整合执行者caspase动态监测、凋亡诱导增殖与免疫原性细胞死亡研究新工具

本研究针对细胞死亡研究缺乏高时空分辨率动态监测工具的瓶颈，开发了基于ZipGFP/mCherry双荧光报告系统的新型平台。研究人员通过构建含DEVD基序的caspase-3/-7特异性生物传感器，成功在2D/3D培养体系（包括类器官）中实现凋亡进程实时追踪，并创新性整合了凋亡诱导增殖(AIP)检测和钙网蛋白(CALR)介导的免疫原性细胞死亡(ICD)评估。该研究为细胞死亡机制研究提供了多参数、高内涵的分析工具，发表于《Cell Death Discovery》。

　　

在生命科学领域，细胞死亡研究始终是理解组织稳态、疾病发展和治疗响应的核心课题。传统检测方法如Annexin V染色或TUNEL检测存在明显局限——它们只能提供静态"快照"，无法捕捉凋亡过程的动态特征，在复杂的三维培养体系中更面临染料渗透差、光漂白等问题。尤其当研究免疫原性细胞死亡(ICD)或凋亡诱导增殖(AIP)这类涉及时空协调的生物学现象时，现有技术手段的不足更为凸显。

来自德国柏林Max-Delbrück分子医学中心的研究团队在《Cell Death Discovery》发表创新成果，他们开发了基于ZipGFP/mCherry的稳定荧光报告系统。这个平台巧妙利用分裂GFP技术原理：将GFP分为β-链1-10和第11β-链两个片段，通过含DEVD（天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸）序列的柔性接头连接。当caspase-3/7激活时，切割DEVD基序使GFP片段自发重组恢复荧光，从而实现对凋亡进程的实时、特异性标记。该系统还整合mCherry作为细胞存在内参，并通过增殖染料追踪AIP，结合流式检测CALR暴露评估ICD，形成了多维度的细胞死亡分析平台。

研究采用四大关键技术：1）构建含DEVD-ZipGFP-T2A-mCherry序列的慢病毒载体，建立稳定转染细胞系；2）应用IncuCyte?活细胞成像系统进行长达120小时的动态监测；3）在HUVEC球体和胰腺导管腺癌患者来源类器官(PDAC-PDO)中验证3D模型适用性；4）通过流式细胞术同步检测Annexin V/PI凋亡标志和CALR表面暴露。

【生成和验证稳定的caspase-3/7报告细胞】部分显示，在蛋白酶体抑制剂carfilzomib处理后，MiaPaCa-2报告细胞的GFP荧光强度呈时间依赖性增强，而泛caspase抑制剂zVAD-FMK可完全阻断该信号。Western blot证实cleaved PARP和cleaved caspase-3增加，流式检测到Annexin V⁺细胞比例升高。值得注意的是，在caspase-3缺陷的MCF-7细胞中仍能检测到信号，证实caspase-7单独即可激活报告系统。

【在3D球体和类器官模型中的应用】部分证明，该系统能清晰捕捉三维培养中凋亡信号的时空异质性。在基质胶嵌入的PDAC-PDO中，可观察到凋亡从结构外围向中心区域的梯度扩散，这与临床肿瘤对治疗反应的异质性高度相似。

【凋亡诱导增殖的动态检测】部分创新性地结合SE增殖染料，发现亚致死剂量oxaliplatin处理时，局部凋亡区域与邻近细胞增殖呈现显著负相关（Spearman r=-0.82），为"凤凰效应"理论提供了直接证据。

【同步检测caspase激活和免疫原性细胞死亡】部分揭示，carfilzomib能诱导CALR⁺/caspase^-细胞亚群，而经典ICD诱导剂oxaliplatin则产生CALR⁺/caspase⁺混合群体，提示存在caspase依赖与非依赖两种ICD通路。

这项研究通过工程学智慧解决了细胞死亡研究中的关键技术瓶颈。其创新价值体现在：1）首次实现执行者caspase活性、AIP和ICD标志物的同步动态监测；2）突破3D模型凋亡检测的技术障碍；3）发现carfilzomib可能通过非经典途径诱导ICD的治疗学意义。平台的应用前景广阔，未来可通过整合pyroptosis（焦亡）和necroptosis（坏死性凋亡）传感器，发展为更全面的PANoptosis（泛凋亡）研究系统。对于肿瘤治疗抵抗机制解析、免疫疗法优化以及再生医学研究都具有重要指导价值。