工程化半胱氨酸蛋白酶域实现蛋白质N端定制化表达的创新策略

研究人员针对蛋白质N端甲硫氨酸(Met)或纯化标签去除难题，开发了一种基于工程化半胱氨酸蛋白酶域(CPD)的化学诱导切割系统。通过系统设计N端CPD标签，成功实现了除脯氨酸(Pro)外多种N端氨基酸(如Gly/Ser/His/Lys等)的精准定制，并在Her2靶向纳米抗体、RNF43纳米抗体(N-Gln)、EGFR纳米抗体(N-Ala)等多种蛋白体系中验证了该策略的普适性。该技术为研究N端修饰功能提供了高效工具，相关成果发表于《Communications Biology》。

　　

在蛋白质功能研究中，N端氨基酸的身份往往决定着蛋白质的稳定性、定位和功能调控。然而现有技术面临两大瓶颈：传统酶切方法依赖特定识别序列，而化学切割试剂如氰化溴(CNBr)需要在强酸条件下进行，易导致蛋白质变性。更棘手的是，常规方法难以精确控制目标蛋白的N端氨基酸种类，严重制约了N端修饰（如乙酰化、豆蔻酰化）的功能研究。

中国科学院上海药物研究所等单位的研究人员突破性地改造了霍乱弧菌MARTX毒素中的半胱氨酸蛋白酶域(CPD)，开发出可化学诱导的蛋白质N端定制系统。该团队通过关键位点突变(L207I/L214A)消除CPD的自剪切活性，利用肌醇六磷酸(InsP₆)特异性触发切割反应，成功实现了目标蛋白N端氨基酸的"按需定制"。相关研究成果发表在《Nature》旗下期刊《Communications Biology》。

研究主要采用四大关键技术：1) 蛋白质理性设计改造CPD结构域；2) 大肠杆菌重组表达系统生产融合蛋白；3) 高效液相色谱-高分辨质谱(HPLC-HRMS)监测切割过程；4) AlphaFold2预测蛋白结构指导突变设计。

工程化CPD标签的设计与优化

通过系统比较CPD在蛋白质N端和C端的融合效果，发现L207和L214是主要干扰位点。双突变体L207I/L214A能完全消除非特异性切割，而缩短的GS连接肽可加速反应。优化后体系在pH7.5、37℃条件下，仅需1mM InsP₆即可在8小时内完成切割。

N端氨基酸的广谱性验证

在纳米抗体模型中，除Pro外19种氨基酸均被测试。结果显示：Ala、His、Lys等13种氨基酸能高效生成目标产物，而Phe、Trp等大侧链氨基酸效率较低。特别值得注意的是，酸性氨基酸(Asp/Glu)在不同蛋白中表现差异：在TurboGFP中可成功获得N-Glu产物，但在纳米抗体中会出现非特异性切割。

多类型蛋白质的适用性验证

该系统成功应用于五种功能蛋白：RNF43纳米抗体(N-Gln)、Δ15 Pd2,6ST糖基转移酶(N-Cys)、EGFR纳米抗体(N-Ala)、Sortase A酶(N-Gln)和荧光蛋白TurboGFP(N-Glu)。其中糖基转移酶的切割效率最高，仅需8小时即可完成。

无标签纯化系统的开发

通过将His标签整合到nCPD的N端或C端，建立了一步法纯化流程。Ni柱吸附后，InsP₆诱导切割可直接获得无任何残留标签的目标蛋白，为临床级蛋白制备提供了新思路。

该研究揭示了CPD的自剪切(auto-processing)优于反式剪切(trans-processing)的机制特征。通过AlphaFold2结构预测发现，工程化后的CPD其催化中心(Cys144)与切割位点(L234)的空间构象更利于特异性水解。这种化学诱导、无需外加蛋白酶的标签去除策略，不仅克服了传统方法的条件苛刻、成本高等缺点，更为研究N端氨基酸依赖性功能（如蛋白质半衰期调控、膜定位信号）提供了精准工具。未来在抗体药物开发、工业酶改造等领域具有广阔应用前景。