极端嗜盐菌D-2-羟基酸脱氢酶的钾离子结合机制：羧酸非依赖型嗜盐适应与催化新见解

本研究揭示了极端嗜盐菌Haloferax mediterranei来源的D-2-羟基酸脱氢酶(D2HDH)通过主链羰基簇结合K+离子的独特机制，突破了传统"酸性表面羧基依赖"的嗜盐适应认知。研究人员通过高分辨率晶体结构解析(1.16-2.25 ?)发现，D2HDH利用保守的Arg/Glu/His催化三联体实现NAD(P)H双特异性及广谱底物识别，其4 M KCl环境下的稳定性提升30°C。该发现为有机溶剂中生物催化提供了新型酶工具，发表于《Communications Biology》。

　　

在生物催化领域，极端环境微生物的酶系统因其卓越的稳定性备受关注。嗜盐菌作为"盐入型"(salt-in)生物的代表，通过积累高浓度KCl（4-5 M）对抗外界渗透压，但其蛋白质在低水活度条件下保持活性的分子机制仍存争议。传统观点认为，嗜盐蛋白依赖表面密集的酸性残基（如Asp/Glu）和降低的疏水性（减少Lys含量）来维持结构稳定，然而这些特征如何具体转化为功能适应性尚不明确。来自西班牙阿利坎特大学(Universidad de Alicante)的Juan Ferrer团队聚焦Haloferax mediterranei来源的D-2-羟基酸脱氢酶(D2HDH)——一种能催化2-酮酸不对称还原生成手性D-2-羟基酸的重要生物催化剂，通过多维度解析其结构与功能，揭示了颠覆性的嗜盐适应机制，相关成果发表于《Communications Biology》。

研究采用X射线晶体学（最高分辨率1.16 ?）、分析超速离心和酶动力学分析等关键技术。通过解析D2HDH与NAD(P)⁺/2-酮己酸复合物的6种晶体结构（PDB代码：9ibe、8qzb等），结合不同盐浓度下的酶活性和热稳定性检测，系统阐明了其催化机制与离子依赖性。

域闭合与底物结合特征

D2HDH呈现典型的2HADH家族二聚体结构，含d1（1-92/283-308残基）和d2（93-282残基）两个结构域。底物结合引发18°域旋转，使催化His274与底物C2距离缩短至3.5 ?。有趣的是，2-酮己酸在晶体中呈现"生产性"（si面朝向辅酶）和"流产性"（re面朝向辅酶）两种结合模式，后者因底物羧基/酮基位置互换导致催化受阻。

双辅酶特异性分子基础

NADPH比NADH更高的亲和力源于其2'-磷酸基与Arg165/Ser167的相互作用。在NAD⁺复合物中，Cl^-或SO₄^2-可模拟该磷酸基位置，解释为何高KCl浓度下NADH活性提升至NADPH水平（4 M KCl时k_cat/K_M达1536 mM^-1 min^-1）。

嗜盐适应新机制

23个K⁺结合位点的鉴定（7个/单体）显示：65%配体为主链羰基（如Gly205、Glu213），仅20%为羟基，完全不含表面羧基。这些羰基簇形成几何特异的结合口袋（配位数6-8），通过稳定局部构象增强整体刚性，使Tm值随KCl浓度（0.05→4 M）提升30°C。比较基因组学揭示该机制在H. mediterranei葡萄糖脱氢酶(GlcDH)等嗜盐蛋白中保守存在。

生物催化应用潜力

D2HDH在20% DMSO/乙醇中保持80%活性，对C3-C6链长2-酮酸的k_cat/K_M达180-5928 mM^-1 min^-1，其羰基-K⁺相互作用模式为设计有机溶剂耐受酶提供了新思路。

该研究首次证实主链羰基簇可作为K⁺结合位点参与嗜盐适应，突破了"酸性残基中心论"的认知边界。D2HDH展现的"盐激活"特性（活性随KCl浓度递增）与羰基介导的离子稳定策略，为开发极端环境生物催化剂提供了理论框架。其广谱底物识别能力与双辅酶特异性，更使该酶成为手性药物中间体绿色合成的理想候选。