基于氧传递速率在线监测的Komagataella phaffii工程化植酸酶高通量筛选新策略

本研究针对植酸酶工程化改造中传统离线筛选方法效率低下的问题，开发了基于氧传递速率（OTR）在线监测的双路径高通量筛选系统。研究人员通过Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）表达系统的代谢负担分析和植酸依赖性生长筛选，实现了对重组蛋白产量和植酸酶活性的同步评估。该研究在《Microbial Cell Factories》发表的方法可减少83%的离线检测工作量，为酶定向进化提供了高效筛选工具。

　　

在可持续生物经济发展的背景下，植物副产品中植酸（phytic acid）的磷酸盐回收成为解决磷资源枯竭的新思路。植酸酶（phytase）作为能水解植酸释放磷酸的关键酶，其工业化应用面临热稳定性、pH耐受性和比活性（specific activity）等多重挑战。传统筛选方法需要耗费大量人力物力进行终点检测，而德国亚琛工业大学（RWTH Aachen University）生物化学工程研究所的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究，创新性地将呼吸代谢分析与底物限制生长相结合，建立了革命性的高通量筛选平台。

研究采用两种关键技术：① 基于μTOM（微尺度在线传质监测）装置的96孔板培养系统，通过氧传递速率（OTR）实时监测代谢负担；② 开发了以植酸为唯一磷源的Syn6 MES培养基，通过生长速率反映植酸酶活性。实验使用包含JE10、JE11等突变文库的Komagataella phaffii BSYBG11（MutS）菌株，通过BCA法和4-MUP（4-甲基伞形酮磷酸）荧光检测进行验证。

代谢负担反映蛋白产量

在YPD培养基中，高表达克隆的μ_max（最大比生长速率）显著降低（0.25 vs 0.05 h^-1），与BCA法测定的总蛋白浓度（0.5-2.5 g/L）呈负相关。毛细管电泳证实分泌型植酸酶占蛋白总量的1.6±0.69%，但该方法难以区分中/高产菌株。

植酸限制筛选活性变异体

创新性设计的Syn6 MES培养基（含0.55 g/L植酸）中，活性克隆CB30(1)的OTR峰值达15 mmol/L/h，显著高于空载体（5 mmol/L/h）。生长速率与4-MUP法测定的体积活性（volumetric activity）呈线性相关（R²>0.8），且野生型与突变体的活性差异可被准确区分。

双路径筛选的协同效应

通过整合代谢负担（反映蛋白浓度[g/L]）和植酸生长（反映U/mL活性）数据，可直接计算比活性（U/mg）。在96克隆筛选中，基于OTR的预选策略可识别83%的高活性变异体，使离线检测工作量减少75%。

该研究的突破性在于：① 首次实现植酸酶产量与活性的同步在线评估；② 建立的植酸依赖性生长模型可拓展至其他磷酸酯酶筛选；③ 为工业酶改造提供了每小时960克隆的超高通量筛选方案。特别是对需要处理InsP₄-InsP₁等低磷酸肌醇的酶变体筛选具有重要指导价值，为生物磷循环技术开发奠定了方法学基础。