RNAi表观突变介导的抗真菌药物耐药性可跨代遗传及其在病原真菌适应性进化中的意义

本研究针对真菌病原体对抗真菌药物产生耐药性(fAMR)这一全球健康威胁，发现RNA干扰(RNAi)介导的表观遗传突变(epimutations)能在人类致病真菌卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中通过有性生殖实现跨代遗传。研究人员通过全基因组测序、小RNA分析和染色质免疫沉淀等技术，首次证实siRNA分子可独立于DNA序列和异染色质修饰(H3K9me)，以非孟德尔遗传模式传递耐药性状。该发现为理解真核病原体的表型可塑性提供了新视角，对应对日益严峻的抗微生物药物耐药性(AMR)挑战具有重要意义。

在抗微生物药物耐药性(AMR)日益威胁全球健康的背景下，真菌感染因其有限的治疗选择和快速发展的耐药性被世界卫生组织(WHO)列为重点研究领域。传统认知中，药物耐药性主要源于DNA序列突变，但近年来研究发现，不改变DNA序列的表观遗传突变(epimutations)同样能介导耐药性。这种现象在真菌中尤为引人关注——当面临FK506等抗真菌药物压力时，某些真菌会通过RNA干扰(RNAi)途径产生靶向药物作用基因的小RNA(siRNA)，暂时沉默关键基因表达而获得耐药性。然而，这种表观遗传变异能否像基因突变一样稳定遗传给后代，特别是通过有性生殖途径传递，始终是未解之谜。

Duke University的研究团队选择人类致病真菌卷枝毛霉(Mucor circinelloides)PS15为模型，这是毛霉目中少数能在实验室完成有性循环的物种。通过牛津纳米孔技术(ONT)完成两性交配型(PS15-和PS15+)的全基因组测序后，研究人员首先验证了该物种具备完整的RNAi通路组分。在FK506和雷帕霉素双重压力下筛选获得14株耐药菌株，其中9株未发现fkbp12基因(fkbA)突变但呈现不稳定的耐药表型——这正是RNAi表观突变的典型特征。Northern blot和sRNA测序证实这些"表观突变体"(Epimutants)积累了靶向fkbA的反义siRNA，伴随fkbA mRNA水平下降，而撤除药物压力后表型可逆。

为验证表观突变的遗传性，研究团队设计了三组有性杂交实验：(1)表观突变体(雌或雄)×野生型；(2)双表观突变体杂交；(3)野生型对照。通过单孢分离获得F1代后，发现耐药性状以27.3%-77.8%的非孟德尔比率遗传，显著区别于基因突变的50%或100%遗传率。全基因组SNP分析证实子代确实经历了减数分裂重组，但耐药性状与fkbA基因座无遗传连锁——约半数耐药子代甚至从野生型亲本继承了fkbA等位基因。染色质免疫沉淀(ChIP)进一步排除了异染色质标记(H3K9me2)的参与，显示RNA聚合酶II(RNAP II)在表观突变体中仍结合fkbA启动子，证实这是纯粹的转录后沉默机制。

最关键的发现来自siRNA特征分析。通过主成分分析(PCA)发现，子代的siRNA丰度模式与亲本存在明显"指纹"相似性：单表观突变亲本的子代聚类靠近该亲本，而双表观突变亲本的子代siRNA谱则呈现亲本特征的混合。这种siRNA的跨代传递不依赖细胞核遗传物质，研究者推测可能通过配子细胞质继承实现。值得注意的是，表观突变的稳定性与siRNA水平无关，所有分离株在无药培养5-10代后均发生回复突变，体现RNAi介导耐药性的动态调节特性。

技术方法上，研究主要采用：①ONT长读长和Illumina短读长测序完成PS15两性基因组组装；②FK506/雷帕霉素双重筛选结合sRNA测序鉴定表观突变体；③单孢分离和减数分裂重组分析追踪性状遗传；④ChIP-seq和RNA-seq解析表观调控机制；⑤Northern blot和qPCR验证siRNA与基因表达关系。

研究结果可归纳为：

1. RNAi表观突变在相反交配型中的诱导：通过药物筛选获得9株不依赖DNA突变的FK506耐药株，sRNA测序显示其特异性积累fkbA靶向siRNA。

2. 有性生殖后的非孟德尔遗传：杂交实验证明耐药性状以27.3-77.8%比率遗传，全基因组分析证实其独立于fkbA基因座遗传。

3. siRNA专属的遗传决定机制：ChIP-seq显示耐药性与H3K9me2修饰无关，RNAP II结合不变，siRNA指纹分析揭示亲本-子代分子特征传承。

4. 跨物种表观突变保守性：在毛霉目其他物种(PS10、PS14)中同样观察到不依赖异染色质的RNAi耐药机制。

这项研究首次在病原真菌中证实RNAi表观突变可通过有性生殖跨代遗传，揭示了siRNA作为独立遗传信息载体的生物学意义。其发现挑战了"中心法则"中DNA作为唯一遗传物质的传统认知，为理解真核生物表型适应性提供了新范式。在医学应用层面，该研究提示临床真菌感染治疗需考虑表观遗传耐药性的检测与防控，为应对日益严峻的fAMR挑战提供了分子理论基础。Nature Communications发表的这项成果，不仅推进了基础表观遗传学发展，也为抗真菌药物研发和耐药性监测策略制定了新方向。