迭代SCRaMbLE技术在合成基因组模块与染色体工程中的应用与优化

本研究针对合成基因组设计中基因排列优化难题，开发了迭代SCRaMbLE（合成染色体LoxPsym介导重组进化）技术结合SCOUT（连续输出追踪系统）的高通量筛选平台。研究人员通过重构酵母组氨酸合成（HIS）模块和合成染色体SynV，利用Cre/loxPsym系统诱导基因组重排，结合流式分选与长读长测序（POLAR-seq），发现基因剂量调控（如HIS5重复）和染色体结构重塑（如114 kb倒位）可显著改善代谢通路功能。该成果为合成基因组模块化设计提供了数据驱动的优化工具，发表于《Nature Communications》。

　　

在合成生物学领域，如何快速优化人工设计的基因组模块一直是重大挑战。传统方法难以系统评估基因排列顺序、拷贝数和方向对功能的影响，而随机突变又缺乏针对性。酵母合成染色体项目Sc2.0虽已构建了含loxPsym位点的基因组，但现有SCRaMbLE技术存在筛选效率低、无法追踪多轮进化等问题。

针对这些瓶颈，英国帝国理工学院（Imperial College London）的研究团队Xinyu Lu、Klaudia Ciurkot等开发了迭代SCRaMbLE技术体系。他们通过改造组氨酸合成通路（HIS）模块和全合成染色体SynV，结合创新的SCOUT荧光报告系统与POLAR-seq长读长测序，实现了从单基因调控到染色体尺度重排的系统优化。相关成果以封面论文形式发表于《Nature Communications》，为合成基因组设计提供了"基因组乐高"式的模块化调试工具。

研究采用三大关键技术：1）构建含loxPsym位点的组氨酸合成模块（包括天然调控的"碎片化"和人工启动子的"重构"版本）；2）开发SCOUT报告系统（基于Cre/loxP变体位点的不可逆GFP开关），通过流式细胞术分选重组细胞；3）建立POLAR-seq方法，对分选细胞库进行长读长测序和基因型-表型关联分析。

设计合成HIS模块揭示表达失衡缺陷

通过CRISPR删除酵母7个HIS基因并重构为20 kb的合成模块，发现混合启动子强度设计的HIS_refactor-4模块在缺乏组氨酸时出现生长缺陷。显微镜显示细胞异常膨大，推测是由于强启动子pTDH3驱动的HIS3与弱启动子pRAD27驱动的HIS5产生150倍表达差异，导致代谢中间体IAP累积。

SCOUT系统实现高效重组筛选

设计的SCOUT报告质粒包含反向mGFPmut2基因和雌激素诱导的CreEBD。当β-雌二醇诱导后，loxP2272/loxP5171位点重组使GFP稳定表达。相比传统方法，RET2启动子驱动的版本泄漏率更低（仅0.03%未诱导背景），流式分选GFP⁺细胞可使重组效率提升300倍。

SCRaMbLE通过HIS5重复挽救缺陷表型

对HIS_refactor-4菌株（yXL219）诱导SCRaMbLE后，POLAR-seq分析显示86.89% reads含8个转录单元（较原始7个增加HIS5重复）。引入第二拷贝HIS5的实验证实，基因剂量增加是表型改善的主因。迭代第二轮SCRaMbLE后，部分菌株出现HIS5三/四重复（占比12.3%），但表型未进一步改善，表明达到局部最优解。

合成染色体迭代SCRaMbLE揭示进化瓶颈

在表达sfGFP的SynV菌株中，五轮SCRaMbLE使荧光强度提升2.1倍。长读长测序发现首轮即产生114 kb倒位（包含着丝粒重定位）和PDA1基因重复——后者与先前β-香树脂酸高产菌株BC03的进化策略一致。值得注意的是，第4-5轮未检测到新重排，且细胞存活率从3.9%（R1）降至0.7%（R5），表明染色体结构变化存在耐受极限。

该研究通过建立"设计-构建-测试-学习"的闭环优化体系，揭示了合成基因组模块的若干设计原则：1）代谢通路对启动子替换具有较高容错性，但关键酶（如HIS5）需避免极端表达失衡；2）基因重复是适应性进化的首选策略；3）着丝粒区域在染色体重排中表现出显著可塑性。这些发现不仅为Sc2.0项目后期染色体整合提供技术支撑，更开创了"进化算法指导基因组设计"的新范式。未来结合转录组和代谢组分析，有望进一步解析基因组三维结构与功能表达的深层关联。