HCV NS5B聚合酶催化RNA 5'-FAD加帽的结构机制解析：新型抗病毒治疗靶点的发现

研究人员针对HCV（丙型肝炎病毒）通过5'-FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）加帽逃逸宿主免疫的机制不明问题，开展NS5B聚合酶催化FAD加帽的结构生物学研究。通过解析NS5B与FAD复合物的晶体结构（分辨率2.25-3.46 ?），发现β-loop441-456的M447/Y448特异性识别FAD，且C端linker通过W550稳定加帽RNA，揭示了一种独特的RNA易位中间态。该研究为开发靶向FAD加帽的抗HCV药物提供新思路，发表于《Nature Communications》。

　　

丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球肝硬化和肝癌的主要诱因，其长期隐匿性感染的关键在于病毒能逃逸宿主免疫清除。近年研究发现，HCV RNA的5'端存在非经典FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）加帽现象，但NS5B（非结构蛋白5B）聚合酶如何催化这一过程尚不清楚。清华大学的研究团队通过高分辨率晶体结构解析，首次揭示了这一独特加帽机制的全景图。

研究采用X射线晶体学（分辨率2.25-3.46 ?）结合ITC（等温滴定量热法）和体外复制实验，构建了NS5B与不同RNA模板（5'-AGGU/ACGU/AUGU/GCCU）的复合物体系。关键发现包括：1）β-loop441-456的M447/Y448通过氢键网络特异性识别FAD的核糖醇基团（K_d=2.26×10^-6 M）；2）FAD腺嘌呤与模板链3'端尿嘧啶严格配对；3）延伸阶段C端linker的W550与模板链-4位尿嘧啶形成"三明治"结构稳定加帽RNA。

研究结果部分：

Structural basis for specific FAD recognition

NS5B通过β-loop441-456的Y448主链氮原子与FAD核糖醇基团形成氢键（距离2.7 ?），且M447/Y448/Y191/F193构成疏水口袋。ITC显示Y448A突变使FAD结合亲和力显著降低，而NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的K_d值比FAD高33倍（7.52×10^-5 vs 2.26×10^-6 M）。

FAD-primed initiation

在FAD-CMP（黄素腺嘌呤二核苷酸-胞苷酸）延伸复合物中，催化中心Mn²⁺ A/B（占有率0.76）激活FAD的3'-羟基，引发对CDP（胞苷二磷酸）α磷酸的亲核攻击。R158/F224/D225/S282构成动态相互作用网络。

Unique translocation intermediate

5'-FAD加帽RNA在延伸阶段诱导特殊构象：产物链-4至-1位碱基发生42.5°-10°旋转位移，破坏碱基配对氢键。C端linker的W550与模板链-4位尿嘧啶形成π-π堆积，促使RNA双链进入易位准备态。

该研究首次阐明HCV利用宿主代谢物FAD实现免疫逃逸的原子机制，突破性地发现NS5B的β-loop441-456和C端linker可作为"双位点"抗病毒靶标。相较于经典m⁷G加帽病毒（如登革病毒），HCV的FAD加帽率更高（>80% vs <1%），这为开发靶向非经典加帽途径的广谱抗病毒药物提供了全新方向。研究揭示的"旋转-易位"模型（图6）也为理解其他RNA病毒聚合酶的工作机制提供了范式。