白色念珠菌β-1,3-葡聚糖交联蛋白Pir1的细胞壁锚定机制：双重复单元的关键作用

本研究针对白色念珠菌(Candida albicans)细胞壁蛋白Pir1的功能争议，通过结构建模与基因编辑技术揭示：含两个Pir重复单元(Q[IV]XDGQ[IVP]Q)是Pir1与β-1,3-葡聚糖共价连接的最小功能模块，关键残基Q92/D95/Q122的突变会完全破坏其锚定能力。该发现为理解真菌细胞壁加固机制提供了分子基础，对开发抗真菌策略具有启示意义。

　　

作为最常见的侵袭性真菌感染病原体，白色念珠菌的细胞壁是其与宿主相互作用的第一道防线，也是抗真菌药物的重要靶标。其中β-1,3-葡聚糖交联蛋白Pir1被认为通过形成酯键连接细胞壁多糖网络，但前期研究对其功能重要性存在争议——早期报道称其缺失会导致严重生长缺陷，而近期研究却显示敲除株表型微弱。这种认知矛盾亟待解决，特别是在白色念珠菌缺乏其他已知葡聚糖交联蛋白的背景下。

西班牙卡斯蒂利亚-拉曼查大学生物医学研究所（Institute for Biomedicine, ETSIAMB, University of Castilla-La Mancha）的研究团队通过多学科方法揭示了Pir1的作用机制。他们首先证实临床分离株中存在4-11个Pir重复单元的天然变异，其中91%菌株至少携带一个含9重复单元的等位基因。通过CRISPR-Cas9构建单/双基因敲除株发现，pir1△/△突变体仅对刚果红（CFW）表现轻微敏感，但对β-1,3-葡聚糖（层粘连蛋白）的粘附能力显著降低34%，提示Pir1确实参与葡聚糖结合但非生存必需。

研究的关键突破在于结构-功能分析。AlphaFold2建模显示Pir1具有由反平行β-折叠构成的核心结构域，周围环绕含重复单元的无序环。引人注目的是，截短实验证明仅含两个重复单元的Pir1_2r即可实现高效细胞壁锚定（通过碱提取和免疫荧光验证），且能完全恢复葡聚糖结合功能。而定点突变揭示第一重复的Q92/D95和第二重复的Q122是酯键形成的关键残基——这些位点突变会使蛋白完全丧失壁锚定能力，如同在敲除株中观察到层粘连蛋白结合缺陷。

主要技术方法包括：1）CRISPR-Cas9构建pir1/pir32单/双敲除株；2）临床菌株PIR1等位基因测序分析；3）AlphaFold2蛋白结构预测；4）截短体与点突变体功能回补实验；5）免疫印迹与共聚焦显微镜检测壁锚定效率；6）层粘连蛋白粘附定量分析。

Pir1介导体外β-1,3-葡聚糖结合

通过流式细胞术证实pir1△/△突变体对层粘连蛋白的粘附下降34%，而回补完整PIR1基因可恢复该表型，首次实验验证了Pir1的葡聚糖结合功能。

Pir1结构：反平行β-折叠核心与外部重复环

结构预测发现天然Pir1变体均有一个重复单元嵌入核心β-折叠之间，其余位于表面环。截短实验显示仅当存在两个重复时才会形成功能性外部环，暗示这是最小功能单元。

两个Pir1重复是壁锚定必要且充分条件

含两个重复的Pir1_2r在免疫印迹中显示比野生型更强的壁结合信号，且完全恢复葡聚糖结合能力；而单重复或无重复构建体则完全丧失锚定功能，证实"双重复模块"假说。

关键重复残基决定壁锚定效率

通过系统突变重复单元中的保守氨基酸，发现Q92A/D95N（第一重复）和Q122A（第二重复）突变会完全阻断壁结合，揭示这些残基可能直接参与酯键形成。

这项研究不仅解决了关于Pir1功能重要性的长期争议，更阐明了其作用机制的结构基础。发现两个Pir重复单元构成最小功能模块，为理解真菌细胞壁的动态组装提供了新视角。尽管白色念珠菌pir1缺失株未表现严重缺陷，但研究者推测其他蛋白（如Bgl2/Gas/Phr/Crh家族转糖基酶）可能补偿了葡聚糖交联功能。该发现对开发针对细胞壁组装关键节点的抗真菌策略具有指导价值，特别是考虑到Pir1在应激条件下表达上调的特性。论文发表于《FEMS Yeast Research》，为真菌细胞壁研究领域提供了重要方法论范例和理论框架。