RNA互作组捕获技术揭示SRSF3作为疱疹病毒基因表达的关键调控蛋白

为解决疱疹病毒mRNA稳定性与核输出机制不明的问题，研究人员通过优化LNA/DNA混合探针捕获技术，结合eCLIP分析，发现病毒RNA调控因子ORF57直接结合AU富集motif，并鉴定出宿主剪接因子SRSF3是调控KSHV（卡波西肉瘤相关疱疹病毒）感染性的关键蛋白。该研究为理解病毒mRNP组装规律提供了新方法，发表于《PNAS Nexus》。

　　

疱疹病毒在感染过程中面临一个关键挑战：其基因组中大量基因缺乏内含子，这使得病毒mRNA难以通过常规的剪接依赖性途径实现核输出和翻译。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）通过病毒RNA调控因子ORF57解决这一难题，但其具体作用机制和宿主因子参与情况尚不明确。更复杂的是，KSHV的裂解期基因具有异常高的AT含量（49.6%），这种序列特征通常不利于基因表达，但ORF57如何选择性激活这些转录本仍是未解之谜。

德国汉诺威医学院（Hannover Medical School）病毒学研究所的Carolin Vogt团队通过创新性技术手段，揭示了这一过程的分子机制。研究人员首先优化了锁核酸（LNA）/DNA混合探针捕获技术，使其适用于低丰度的病毒转录本分析。该方法结合紫外交联和质谱分析，首次实现了对单个病毒mRNA结合蛋白组（RBPome）的高精度鉴定。研究团队选取ORF57依赖的典型病毒基因ORF47（504 nt）作为模型，发现ORF57能直接结合AU富集序列，并通过eCLIP技术在全基因组范围验证了这一结合特性——46%的ORF57结合位点含有特征性AU motif。

关键技术包括：1）改进的LNA/DNA混合探针捕获技术用于低丰度RNA-蛋白复合物富集；2）增强型紫外交联免疫沉淀（eCLIP）解析ORF57全基因组结合特征；3）iSLK rKSHV.219细胞模型模拟病毒裂解期反应；4）shRNA敲降与过表达实验验证功能机制。

LNA mixmer捕获揭示裂解期KSHV转录本的RBP组特征

通过比较野生型ORF47与序列优化（GC含量提高11.5%）的synORF47转录本，发现hnRNP蛋白结合减少而SR蛋白（如SRSF3）结合保持稳定。质谱鉴定出28种显著富集的RNA结合蛋白（RBPs），包括RBM15、TIA1等已知AU序列结合蛋白（表1）。

ORF57直接结合病毒转录本的AU富集motif

eCLIP数据显示ORF57在KSHV基因组上有1，892个结合位点，其中PAN RNA（最丰富的裂解期转录本）占70-78%的结合信号。发现的核心AU motif（图2C）解释了ORF57对病毒转录本的特异性识别。

SRSF3的双重调控功能

敲降实验显示SRSF3对ORF47表达具有奇特的双向调控：在基础状态下促进RNA降解（与EBV中报道一致），但在ORF57存在时转为协同激活（图3B-D）。过表达实验进一步证实SRSF3能独立于ORF57激活所有测试的裂解期基因（图4A-F），但对HIV GFP报告基因无影响，说明其作用具有序列特异性。

病毒裂解期转录本的捕获验证

在病毒感染的iSLK细胞中，ORF6转录本捕获鉴定出57种核心RBPs（图5D），其中ORF6蛋白自身也被捕获，提示其可能具有意外RNA结合功能。SRSF3的感染性实验显示，其敲降使病毒滴度降低2倍（图6C），主要影响病毒粒子释放而非DNA复制（图6D-E）。

该研究首次系统解析了疱疹病毒mRNP的组成规律，揭示SRSF3作为"分子开关"的双重功能：既是宿主防御机制的执行者，又是病毒高效复制的共谋者。ORF57通过AU motif识别实现病毒转录本的特异性保护，这种机制可能普遍存在于疱疹病毒科。优化的LNA捕获技术为研究其他病毒RNA-蛋白互作提供了范式，而SRSF3的调控特性为抗病毒靶点开发提供了新思路。值得注意的是，研究还发现密码子优化会显著改变mRNP组成（图1D），这对基于序列修饰的基因治疗策略具有重要启示。