发光减毒SARS-CoV-2用于耐药突变株鉴定与验证的研究

这篇研究构建了表达纳米荧光素酶(Nluc)且缺失ORF3a/7b的减毒重组SARS-CoV-2(Δ3a7b-Nluc)，通过连续传代筛选出对主要蛋白酶(Mpro)抑制剂尼马特雷韦(nirmatrelvir)耐药的突变株，鉴定出NSP5基因的L50F和R188G突变，证实其可降低药物敏感性11倍。该平台避免了野生型(WT)病毒的功能获得性(GoF)研究风险，为安全评估抗病毒药物耐药性提供了新策略。

　　

生成与表征rSARS-CoV-2 Δ3a7b-Nluc

研究团队在SARS-CoV-2 WA1/2020株基础上构建了缺失ORF3a/7b并表达Nluc的重组病毒Δ3a7b-Nluc。该病毒在Vero-AT细胞中形成的噬斑小于野生型，但添加Nluc底物后可见荧光信号。生长动力学显示其复制能力与亲本Δ3a7b相当，均低于野生型病毒。Nluc活性在感染48小时达到峰值，与病毒滴度变化一致。药物敏感性测试表明，Δ3a7b-Nluc对尼马特雷韦和瑞德西韦(remdesivir)的EC₅₀值与野生型病毒文献值相似，证实其可作为药物筛选平台。

尼马特雷韦耐药突变株(DRM-N)的筛选

通过10次递增浓度(1-40 μM)的尼马特雷韦压力传代，获得了耐药性增强的P10 Δ3a7b-Nluc DRM-N。免疫荧光显示2.5 μM药物即可抑制亲本病毒，而耐药株在40 μM时仍能复制。定量分析证实耐药株对尼马特雷韦的EC₅₀值提升14-23倍（PRNT:12.88 μM vs 0.95 μM；OD₅₆₀:13.96 μM vs 0.61 μM），但对瑞德西韦保持敏感，表明耐药性具有特异性。

耐药突变位点的鉴定与验证

全基因组测序发现DRM-N在NSP5基因存在L50F和R188G突变，该结果经Sanger测序确认。反向遗传学构建的单突变株L50F和R188G均显示约5倍EC₅₀升高，而双突变株L50F+R188G耐药性提升11倍(6.07 μM vs 0.56 μM)。值得注意的是，R188G导致噬斑缩小和生长延迟，但L50F能补偿这种适应性代价，双突变株的噬斑形态恢复至亲本病毒水平。

耐药机制的结构基础

冷冻电镜结构分析显示，L50和R188位于Mpro的疏水S2口袋附近。L50F通过苯丙氨酸侧链增强与Q189的疏水作用，稳定酶活性中心；R188G则以亲水性更弱的甘氨酸增加S2口袋紧密度。虽然两者不直接参与尼马特雷韦结合，但通过变构效应影响酶-底物相互作用。这与既往报道的L50F+E166V复合突变机制形成对比，后者可使耐药性提升80倍。

研究意义与展望

该研究建立的Δ3a7b-Nluc平台兼具生物安全性和功能性：ORF3a/7b缺失使其在小鼠和仓鼠模型中完全减毒，而Nluc报告系统便于实时监测。相较于野生型病毒，该平台能在BSL-2+条件下开展耐药研究，规避了GoF争议。发现的L50F/R188G突变为临床监测提供了新靶点，此前已在免疫抑制患者长期使用帕克斯洛维德(paxlovid)后检出类似突变。未来该技术可扩展至其他抗病毒药物（如莫努匹拉韦）或疫苗逃逸株的研究，为应对SARS-CoV-2持续进化提供预判工具。

实验方法学要点

所有操作在BSL-3（野生型）或BSL-2+（Δ3a7b-Nluc）实验室完成。病毒通过BAC系统在Vero-AT细胞中拯救，采用噬斑减少试验(PRNT)、结晶紫染色(OD₅₆₀)和Nluc活性三种方法平行评估EC₅₀。高通量测序使用Illumina NovaSeq 6000平台，变异分析采用RAVA流程，以rWA1 Δ3a7b-Nluc为参考序列。结构建模基于PDBID:7VH8的Mpro-尼马特雷韦复合物。