冷冻切片增强型超分辨显微技术实现跨细胞与组织的单蛋白成像与定量分析

本文提出tkPAINT技术，通过整合冷冻切片（Tokuyasu cryosectioning）与DNA-PAINT超分辨显微术，实现3 nm定位精度的单蛋白成像。该技术突破TIRF轴向限制，增强成像动力学（imager binding kinetics），支持核内RNA聚合酶II（Pol II S5p）分子计数，为细胞生物学与生物医学研究提供全新工具。

　　

技术原理与创新

冷冻切片增强型超分辨显微技术（tkPAINT）通过物理切片将样本厚度压缩至150 nm，与全内反射荧光（TIRF）照明范围匹配，解决了传统DNA-PAINT在厚样本中分辨率下降的问题。该技术采用Tokuyasu冷冻切片法，保留细胞超微结构的同时提升抗原可及性，结合速度优化的成像探针（如R4 imager），将定位精度提升至3 nm，较传统HILO成像提高近3倍。

单抗体分辨率与分子计数

tkPAINT通过二次纳米抗体标记减少空间位阻，实现单抗体级分辨率（FWHM≈9 nm）。利用qPAINT算法分析成像探针结合动力学，定量核内Pol II S5p抗体密度（165±45 μm^-3），揭示转录工厂中抗体簇分布异质性。小鼠小脑与脾脏组织实验验证技术普适性，发现小脑核内抗体密度存在双峰分布（峰值2.5抗体/簇），暗示组织特异性转录调控模式。

多模态与三维拓展

技术支持Exchange-PAINT多靶点序贯成像，同步解析核纤层蛋白（Lamin A/C）、核斑标记物（SC35）与Pol II的空间互作。结合荧光原位杂交（FISH），实现蛋白质与核酸共定位（如端粒重复序列与α-微管蛋白）。通过柱面透镜引入像散，实现轴向分辨率20 nm的三维成像，证实抗体标记可穿透150 nm切片全层，但SC35在切片顶部富集，提示标记渗透差异。

应用前景与局限

tkPAINT为染色质空间组织、转录机器纳米级排列等研究提供工具，但抗体标记效率与立体阻碍可能低估真实分子数。未来可结合高压冷冻固定（high-pressure freezing）减少人工假象，或通过基因编码标签（如HaloTag）提升标记特异性。技术拓展方向包括串行切片体积重建、关联电镜超微结构解析，以及机器学习加速图像处理。

技术比较与生物学启示

与传统全细胞DNA-PAINT相比，tkPAINT在核内靶标成像中展现显著优势：定位精度从8.3 nm提升至3 nm，抗体结合频率提高80%，且无需透化处理即可穿透核膜。对Pol II S5p的定量揭示HeLa细胞核内约115,000个抗体位点，其在小鼠小脑中的聚集模式差异为神经细胞特异性转录调控提供新线索。该技术框架有望推动超分辨显微从方法开发向生物学问题驱动的范式转变。