靶向人源ISG15蛋白特异性纳米抗体的鉴定与功能研究：揭示泛素样修饰新机制

针对ISG15生物学研究工具匮乏的现状，波士顿儿童医院团队通过羊驼免疫和噬菌体展示技术，成功开发出靶向人源ISG15不同结构域的高亲和力纳米抗体VHHISG15-A和VHHISG15-B。该研究通过结构解析和功能验证，揭示了纳米抗体抑制USP16介导的去ISGylation的分子机制，为探索ISG15在癌症、炎症等疾病中的作用提供了新型分子工具。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，泛素-泛素样蛋白修饰系统犹如分子世界的"化学标签"，决定着蛋白质的命运与功能。其中干扰素刺激基因15（ISG15）作为一种特殊的泛素样修饰蛋白（Ubiquitin-like modifier），不仅参与细胞内蛋白质的翻译后修饰，还具有分泌型细胞因子的双重身份。然而，由于ISG15修饰底物丰度低、研究工具匮乏，科学家们对其在癌症、神经退行性疾病和病毒感染等病理过程中的作用机制始终雾里看花。

波士顿儿童医院细胞与分子医学项目（Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School）的研究团队另辟蹊径，从羊驼免疫系统寻找突破口。他们通过免疫羊驼获得人源ISG15特异性纳米抗体，结合结构生物学和功能分析，成功开发出两把精准的"分子手术刀"——分别靶向ISG15碳端和氮端结构域的VHH_ISG15-A和VHH_ISG15-B。这项突破性成果发表于《Journal of Biological Chemistry》，为解密ISG15生物学功能提供了全新工具。

研究团队运用噬菌体展示技术筛选纳米抗体，通过生物层干涉仪（BLI）测定结合动力学，结合X射线晶体学和核磁共振（NMR）解析复合物结构，并采用质谱技术分析ISG15修饰组。关键实验还涉及USP16去ISGylation活性抑制分析，以及利用基因编辑的HAP1 USP18KO细胞系进行功能验证。

识别人源ISG15特异性纳米抗体

通过羊驼免疫和噬菌体展示技术，从构建的纳米抗体文库中筛选出20个独特序列。其中VHH_ISG15-A和VHH_ISG15-B分别采用不同胚系V区基因，互补决定区CDR3序列差异显著，提示其可能识别ISG15的不同表位。

ISG15特异性纳米抗体的结合验证

尺寸排阻色谱（SEC）证实两种纳米抗体可同时结合ISG15。BLI分析显示VHH_ISG15-B亲和力（K_D=2.88 nM）比VHH_ISG15-A（K_D=101.2 nM）高35倍。值得注意的是，两者均不识别小鼠ISG15，这源于人鼠ISG15结合位点关键残基的差异。

ISG15-VHH复合物的溶液NMR分析

¹⁵N标记的ISG15核磁谱图显示，VHH_ISG15-A主要扰动ISG15碳端泛素样结构域的化学位移，而VHH_ISG15-B则作用于氮端结构域，证实两者识别不同表位。

ISG15特异性纳米抗体的结合特征

2.6 ?分辨率的晶体结构揭示，VHH_ISG15-A通过CDR3环的L101和W102与ISG15的R99、H106形成氢键网络。AlphaFold3预测VHH_ISG15-B则通过F33、F98等残基与ISG15氮端结构域的疏水口袋结合。点突变实验验证了V74D（ISG15）和F98D（VHH_ISG15-B）会完全破坏结合。

ISG15特异性VHHs的生化特性

VHH_ISG15-A能在变性条件下识别游离ISG15，而VHH_ISG15-B则无此特性。两种纳米抗体均可从干扰素刺激的细胞裂解液中高效富集ISG15化底物，质谱分析鉴定出包括ALDOA、GOT1在内的17种已知ISG15修饰蛋白。

VHH_ISG15-A而非VHH_ISG15-B在体外抑制USP16介导的去ISGylation

结构比对发现VHH_ISG15-A与USP16在ISG15碳端结构域存在空间位阻。功能实验证实VHH_ISG15-A能完全阻断USP16对proISG15前体的加工，以及对细胞裂解物中ISG15化底物的去修饰作用。

这项研究不仅填补了ISG15研究工具的空缺，更开辟了多条探索路径：两种纳米抗体可作为"分子探针"解密ISG15双结构域的功能分工；其物种特异性为开发人源化动物模型提供线索；而VHH_ISG15-A对USP16的特异性抑制，则暗示了干预ISG15相关疾病的潜在新策略。正如作者在讨论中指出，这些纳米抗体工具将助力科学家"绘制"ISG15修饰图谱，揭示其在天然免疫、肿瘤微环境等复杂生物学过程中的精确调控机制。

值得注意的是，该研究仍存在局限：纳米抗体的小鼠交叉反应性缺失限制了其在常规动物模型中的应用；细胞内表达这些纳米抗体对ISGylation动态的影响仍需验证。这些未解之谜恰恰为后续研究指明了方向——或许在不久的将来，基于这些纳米抗体的诊断试剂或靶向药物将从实验室走向临床，为ISG15相关疾病的诊治带来新曙光。