免疫激光捕获显微切割联合RNA测序技术实现灌注固定小鼠脑组织的高分辨率空间转录组分析

本研究创新性地开发了一种将灌注固定与免疫激光捕获显微切割(immuno-LCM)相结合的技术方案，成功解决了甲醛(PFA)固定导致的RNA完整性(RIN)受损难题。通过系统优化固定、免疫染色和蛋白酶消化步骤，首次实现了从脑微血管组织中提取高质量RNA（检测到约22,000个基因），为空间组学(spatial omics)研究提供了可靠方法学支撑。

　　

Highlight

【突破性进展】通过逆转甲醛(PFA)交联作用，成功实现免疫激光捕获显微切割(immuno-LCM)与RNA测序(RNA-seq)的无缝衔接，为空间转录组学研究开辟新途径。

Background

传统免疫激光捕获显微切割技术面临的核心矛盾在于：甲醛固定虽能完美保存组织形态，但其形成的RNA-蛋白质交联网络严重阻碍核酸提取。本研究通过精确控制蛋白酶消化条件，首次在保持RNA完整性(RIN>7)的前提下，实现了固定组织的有效解交联。

New Method

创新性采用"灌注固定+离体后固定"双重保护策略：

1. 活体灌注4%多聚甲醛(PFA)锁定脑组织空间构象

2. 结合梯度升温蛋白酶K消化方案（37°C→65°C）温和释放RNA

3. 配套Zymo RNA提取试剂盒实现微量样本高效回收

Results

质量评估显示：

• Bioanalyzer检测RIN值稳定在7.5±0.3

• RNA-seq检出22,000+基因，涵盖完整血脑屏障(BBB)转录组

• 技术重复间皮尔逊相关系数>0.98

Comparison with existing methods

相较于传统冰冻切片方法：

? 空间分辨率提升3倍（可区分<10μm的相邻细胞）

? 样本保存期延长至12个月

? 支持多重免疫荧光标记

Conclusions

该技术突破为神经血管单元研究提供利器，特别适用于：

• 阿尔茨海默症中血脑屏障渗漏机制的时空解析

• 脑肿瘤微环境异质性研究

• 神经退行性疾病的早期生物标记物发现