可可加工厂废水中分离的短波单胞菌碱性脂肪酶的纯化、表征及其在废水处理中的应用潜力

本研究针对工业废水处理中高成本商业脂肪酶的瓶颈问题，从可可加工厂废水中分离出Brevundimonas diminuta菌株，通过16S rRNA测序鉴定后，采用硫酸铵沉淀和离子交换色谱技术对其分泌的碱性脂肪酶进行部分纯化（回收率50.05%）。该酶在pH 8.0和45°C条件下活性最高，Pb2+和Ba2+可显著增强其活性，对有机溶剂表现出独特耐受性（丙酮提升活性22.56 U/mL）。研究证实该酶能有效水解含油废水（厨房废水FFA提升至43.6 mM），为低成本生物修复提供了新方案。

　　

随着全球食品加工业的快速发展，含油废水处理已成为严峻的环境挑战。传统物理化学处理方法成本高昂且易产生二次污染，而商业脂肪酶（Lipase）价格昂贵限制了其大规模应用。更棘手的是，多数已知脂肪酶在强碱或有机溶剂环境中易失活，难以满足工业需求。在这一背景下，寻找具有特殊环境适应性的新型脂肪酶成为研究热点。

尼日利亚奥巴费米·阿沃洛沃大学（Obafemi Awolowo University）微生物学系的研究人员独辟蹊径，将目光投向尚未充分开发的可可加工厂废水。这种富含脂质的特殊环境可能孕育着具有独特催化特性的微生物。通过系统研究，团队成功分离出一株产碱性脂肪酶的Brevundimonas diminuta菌株，并揭示其酶学特性在废水处理中的巨大潜力，相关成果发表在《The Microbe》期刊。

研究采用三大关键技术：1）基于16S rRNA基因测序的菌种鉴定；2）硫酸铵分级沉淀与CM-Sephadex C-50离子交换色谱联用的酶纯化技术；3）以对硝基苯酚棕榈酸酯（pNPP）为底物的分光光度法活性检测体系。实验设计涵盖从菌株筛选到实际废水处理的完整链条。

【3.1 菌株筛选与鉴定】

研究人员从可可加工厂废水中分离出能在 tributyrin 琼脂上形成透明圈的菌株，经16S rRNA测序确认为Brevundimonas diminuta（GenBank登录号KX349741）。该菌在含橄榄油的培养基中发酵72小时后，获得比活性达206.6 U/mg的粗酶液。

【3.2 部分纯化】

通过70%硫酸铵沉淀和CM-Sephadex C-50层析，酶被纯化3.3倍，回收率50.05%。有趣的是，该脂肪酶在pH 8.0缓冲条件下不结合阳离子交换介质，提示其表面净电荷特性特殊。

【3.3.1 分子量特征】

凝胶过滤显示天然酶分子量为60 kDa，SDS-PAGE则呈现63-65 kDa的双条带，暗示可能存在异构体。这一发现拓展了对微生物脂肪酶结构多样性的认知。

【3.3.2 pH特性】

该酶在pH 6.0-9.0范围内保持活性，最适pH 8.0。值得注意的是，其在pH 8.5下孵育2小时仍保留73.8%活性，这种碱性稳定性显著优于多数报道的微生物脂肪酶。

【3.3.3 温度特性】

45°C时酶活性达到峰值（14.4 U/mL），且在40°C下保持70%活性达1小时。这种中等耐热性使其适用于常温废水处理场景。

【3.3.4 金属离子效应】

5 mM Pb²⁺使酶活飙升284%，Ba²⁺亦提升240%，而Hg²⁺则完全抑制活性。10 mM EDTA的激活效应（+59%）暗示该酶可能是金属依赖型，这一特性为工业应用中的活性调控提供了新思路。

【3.3.5 有机溶剂耐受】

在10%丙酮中酶活提升至22.56 U/mL，而乙醇则降低活性至7.56 U/mL。这种"亲丙酮"特性使其在非水相催化领域具有独特优势。

【3.4 动力学参数】

非线性回归分析显示该酶对pNPP的K_m为0.1986 mM，V_max达404.2 U/mg，表明其对底物具有极高亲和力。在实际废水处理实验中，添加10%酶液可使厨房废水FFA从17.4 mM提升至43.6 mM，验证了其应用价值。

这项研究首次报道了源自可可加工废水的Brevundimonas diminuta脂肪酶的多维特性。其独特的pH稳定性、金属离子响应性和有机溶剂耐受性，突破了现有脂肪酶的应用局限。特别值得关注的是，该酶在廉价诱导剂（橄榄油）培养基中即能高效表达，且纯化工艺简单，大幅降低了生产成本。研究不仅为含油废水处理提供了新型生物催化剂，其特殊的Ba²⁺激活效应更为工业酶制剂的活性调控开辟了新途径。未来通过蛋白质工程技术进一步优化其热稳定性，有望推动该酶在食品、能源等领域的广泛应用。