米曲霉α-葡萄糖苷酶介导的转糖基化作用在清酒酿造中形成支链寡糖的机制研究

为解决清酒酿造过程中寡糖形成机制不明的问题，日本静冈县立大学的研究团队通过基因敲除米曲霉α-葡萄糖苷酶基因（AgdA/AgdB），结合HILIC-TOF/MS和NMR技术，首次系统鉴定了6种新型寡糖结构，揭示了AgdA和AgdB分别偏好形成α-1,6和α-1,2/α-1,3糖苷键的转糖基化特性，建立了四类寡糖形成模型，为调控清酒风味品质提供了理论依据。

　　

清酒作为日本传统米酒，其独特风味与酿造过程中形成的寡糖密切相关。然而，这些寡糖的产生机制长期存在两大谜团：一是淀粉降解产物如何通过酶促反应转化为复杂支链结构，二是米曲霉（Aspergillus oryzae）分泌的多种α-葡萄糖苷酶在其中的具体作用。过去研究虽发现清酒中存在α-1,2、α-1,3等非常规糖苷键，但受限于分析技术，无法明确其形成途径。更棘手的是，近年发现的DP6-1等新型寡糖具有相邻双分支结构，彻底颠覆了"支链淀粉不含相邻分支"的传统认知，使得阐明寡糖生物合成机制变得尤为迫切。

日本静冈县立大学综合药学与营养科学研究科的研究团队通过创新性地构建α-葡萄糖苷酶基因敲除菌株，结合先进分析技术，解开了这一困扰学界半个世纪的难题。研究首先通过基因工程手段获得ΔagdA、ΔagdB及双敲除菌株，利用HILIC-TOF/MS（亲水作用色谱-飞行时间质谱）技术对比分析不同菌株酿造的清酒样品，发现α-葡萄糖苷酶缺失会显著改变DP2-8寡糖的组成谱。随后采用活性炭柱层析结合制备型色谱，从清酒中分离出6种新型寡糖，通过600MHz核磁共振仪完成结构解析，包括首次在发酵食品中发现的异麦芽三糖基麦芽糖（DP5d）等复杂结构。

关键技术包括：1）构建米曲霉α-葡萄糖苷酶单/双敲除菌株；2）利用毕赤酵母表达系统制备重组AgdA/rAgdB；3）HILIC-TOF/MS分析DP2-8寡糖；4）NMR解析新型寡糖结构；5）体外转糖基化活性测定。

在"agdB基因敲除菌株构建"部分，研究证实ΔagdB菌株的α-葡萄糖苷酶活性降低10%，而ΔagdAΔagdB双敲除菌株仍保留42%活性，意外发现米曲霉葡萄糖淀粉酶（GlaB）具有水解4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的活性，解释了残余酶活现象。"寡糖谱分析"显示，ΔagdA清酒中异麦芽糖（DP2d）减少37%，证实AgdA是形成α-1,6键的主力；ΔagdB清酒则显著缺失松二糖（DP2a），表明AgdB主导α-1,3键形成。"新型寡糖结构鉴定"中，NMR数据揭示DP3a为α-1,3键连接的尼格糖基葡萄糖，DP3c为罕见的2,4双取代葡萄糖（松糖），DP5d则具有异麦芽三糖基麦芽糖的创新结构。"重组酶体外实验"证明rAgdA偏好生成含连续α-1,6键的异麦芽寡糖，而rAgdB能同时形成α-1,2（科杰二糖）、α-1,3（松二糖）和α-1,6键产物。

研究创新性地提出四类寡糖形成模型：I类（AgdA/AgdB直接催化的小分子寡糖）、II类（AgdA介导的连续α-1,6键结构）、III类（淀粉直接降解的相邻双分支寡糖）和IV类（AgdA合成的纯异麦芽寡糖）。该发现不仅阐明清酒风味物质的形成基础，更修正了淀粉酶学理论——证实相邻分支结构可存在于天然淀粉中，且米曲霉能通过转糖基化"改造"淀粉降解产物。

这项发表于《Food Chemistry》的研究首次系统描绘清酒寡糖的形成网络，为精准调控发酵工艺提供酶学靶点。其建立的分类模型可推广至其他淀粉发酵食品研究，而发现的6种新型寡糖因其特殊糖苷键组合，在益生元开发、抗龋齿功能食品等领域展现出潜在应用价值。特别是证实GlaB具有α-葡萄糖苷酶活性的意外发现，为重新评估发酵体系中糖苷水解酶的功能谱提供了新视角。