基于酵母发酵的乳蛋白精准生产技术：杂质去除与下游工艺优化研究

研究人员针对精准发酵技术生产乳蛋白过程中下游处理成本高、杂质去除难的问题，开展了重组β-乳球蛋白(rBLG)、αs1-酪蛋白(rCSN)和乳铁蛋白(rLTF)的理化特性与纯化策略研究。通过FTIR、HPSEC-UV/RI等技术分析发现，酵母来源的甘露聚糖(mannan)是主要杂质(52-66% d.b.)，采用等电沉淀法可使rCSN纯度达77%，阴离子交换色谱(AEX)虽能提高纯度至64-81%但回收率仅32-37%。该研究为降低食品级重组蛋白生产成本提供了重要技术参考。

　　

在食品工业迈向可持续发展的今天，利用微生物工厂生产动物源性蛋白成为革命性技术。其中通过Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）酵母发酵生产乳蛋白已取得重要进展，但高额的下游处理成本成为制约其产业化的主要瓶颈。特别是发酵液中混杂的酵母细胞壁成分——甘露聚糖(mannan)，其与目标蛋白相似的理化特性使得传统纯化方法效率低下。如何经济高效地获取高纯度重组乳蛋白，成为横亘在科研人员面前的技术难题。

荷兰瓦赫宁根大学食品工艺工程实验室(Wageningen University, Laboratory of Food Process Engineering)的Aryo D. Nugroho等研究人员在《Future Foods》发表的研究，系统评估了三种重组乳蛋白（β-乳球蛋白(rBLG)、α_s1-酪蛋白(rCSN)和乳铁蛋白(rLTF)）的理化特性，并对比了不同纯化策略的效果。研究采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)分析二级结构，高效排阻色谱(HPSEC)测定分子量分布，结合阴离子交换色谱(AEX-LC)和等电沉淀(IEP)等关键技术，全面解析了蛋白-多糖复合体系的分离特性。

在"整体组成与蛋白质构象"部分，研究发现重组乳蛋白与动物源参照物的二级结构相似度达95%，但rCSN的α螺旋含量比牛源参照低8%。通过"碳水化合物分子量与糖组成分析"揭示甘露聚糖是主要杂质（52-66%干基），分子量范围2-242kDa，其中75-87%为甘露糖。"蛋白质分子量与糖蛋白检测"显示rCSN存在糖基化修饰，这通过SDS-PAGE糖染色和LC-MS得到证实，其分子量比理论值增加约4个己糖单元。

"表面电荷"测量发现甘露聚糖会掩盖蛋白固有电荷，使重组蛋白等电点测定产生偏差。"等电点沉淀行为"研究表明仅rCSN能在pH4.5有效沉淀，获得77%纯度的蛋白沉淀，而rBLG和rLTF需变性才能沉淀。"阴离子交换色谱"纯化效果显示，虽然AEX可使蛋白纯度提升至64-81%，但蛋白回收率仅32-37%，且处理过程产生20倍稀释，显著增加后续浓缩成本。

在"基于尺寸分离与甘露聚糖酶解的思考"部分，研究人员发现膜分离技术因蛋白与甘露聚糖分子量重叠而收效甚微。尝试使用α-甘露聚糖酶(α-Mannanase)降解多糖，但21小时仅释放18.6%还原端，证明酵母甘露聚糖的复杂分支结构需要更复杂的酶组合才能有效解聚。

这项研究的重要价值在于明确了K. phaffii表达系统生产重组乳蛋白的关键技术瓶颈。研究发现虽然重组蛋白能保持与天然蛋白高度相似的结构特征，但酵母来源的甘露聚糖杂质显著影响下游纯化效率。特别值得注意的是，不同于常规认知，研究证实等电沉淀法对重组酪蛋白具有独特纯化优势，这为开发经济高效的食品级纯化工艺提供了新思路。对于必须去除杂质的应用场景（如婴儿配方乳铁蛋白），研究建议需要开发新型静电分离技术或优化现有色谱方法。该成果不仅为精准发酵乳蛋白的产业化扫清了技术障碍，其建立的杂质表征方法学也对其他微生物表达系统的下游工艺开发具有借鉴意义。