冻干型壳聚糖纳米纤维-透明质酸复合生物墨水：解决3D生物打印长期储存难题的创新方案

本研究针对纳米纤维基生物墨水在冻干过程中易聚集、再分散性差的关键问题，开发了由壳聚糖纳米纤维(ChitoNFs)、透明质酸钠(HA-Na)和酚化透明质酸(HA-Ph)组成的预混冻干型墨水。该墨水通过静电相互作用抑制纳米纤维聚集，再水化后保持剪切稀化特性和HRP催化凝胶能力，实现高保真三维打印，细胞存活率超90%，线粒体活性提升3.1倍，为生物墨水长期储存提供了创新解决方案。

　　

在生物医学领域，3D生物打印技术正以前所未有的方式改变着组织工程和再生医学的发展轨迹。然而，这项革命性技术面临着一个看似简单却至关重要的挑战——如何长期稳定储存生物活性墨水？传统纳米纤维基墨水在储存过程中容易发生不可逆聚集，就像被暴风雨打湿的蜘蛛网，再难恢复其精妙的网状结构。这种聚集不仅导致墨水粘度不稳定，更会严重影响打印精度和细胞存活率。更棘手的是，生物墨水中的活性成分如蛋白质和多糖，在常规冷藏条件下易发生水解、变性或微生物污染，就像新鲜水果难以长期保鲜一样。

面对这一行业痛点，大阪大学（Osaka University）工程科学研究生院材料工程科学系的Ryo Hirami和Shinji Sakai研究团队独辟蹊径，将目光投向自然界两种神奇的多糖材料：来自甲壳类动物外骨骼的壳聚糖纳米纤维(ChitoNFs)，以及人体关节液中天然存在的透明质酸(HA)。他们创新性地提出"预混冻干"策略，通过正电性的ChitoNFs与负电性HA衍生物之间的静电相互作用，就像给纳米纤维穿上"防护服"，成功解决了冻干过程中的纤维聚集难题。这项突破性研究成果发表在《International Journal of Biological Macromolecules》上，为生物墨水的工业化生产和临床应用扫清了关键障碍。

研究团队采用多项关键技术展开攻关：通过WSCD/NHS介导的碳二亚胺偶联反应合成酚化聚合物（HA-Ph、Gelatin-Ph和Chitosan-Ph）；建立标准化冻干程序确保纳米纤维分散性；利用流变仪系统评估墨水粘度及储能模量(G')/损耗模量(G")；采用离心-吸光度法量化ChitoNFs分散度；开发改良的挤出式3D打印系统进行结构成型；通过压缩测试分析水凝胶力学性能；结合活死染色和线粒体活性检测评估细胞相容性；借助扫描电镜(SEM)观察材料微观结构。

3.1 聚合物-Ph合成

通过¹H NMR和紫外光谱证实，HA-Ph、Gelatin-Ph和Chitosan-Ph的酚基含量分别为2.8×10^-4、9.8×10^-5和4.5×10^-5 mol-Ph/g，为后续凝胶化提供可控交联位点。

3.2 溶液粘弹性

研究发现1.5 w/v% ChitoNFs使0.8 w/v% HA-Na/0.2 w/v% HA-Ph混合溶液在1 s^-1剪切速率下粘度提升6倍，呈现显著剪切稀化行为，而0.5 w/v% Gelatin-Ph对粘度影响较小。

3.3 预混工艺对ChitoNFs分散性的影响

预混工艺处理的冻干墨水经6次离心后吸光度稳定在3.2（600 nm），而传统后混工艺样品吸光度从2.2降至1.9，证实预混能有效防止纳米纤维聚集。

3.4 预混工艺对粘弹性的影响

预混样品再水化后粘度(5.6×10³ mPa·s)是后混工艺的3倍，储能模量测试显示其形成更稳定的纳米纤维网络结构。

3.5 凝胶时间

1.5 w/v% ChitoNFs使凝胶时间从>10 s缩短至约5 s，高粘度环境促进酚基团接触，加速HRP催化交联。

3.6 墨水打印性

含1.5 w/v% ChitoNFs的墨水成功打印出人鼻模型（56层），打印精度参数R值接近√2，证实纳米纤维可有效抑制墨水铺展。

3.7 水凝胶力学性能

ChitoNFs使水凝胶杨氏模量提升4倍至2.1 kPa，1.0 w/v% HA-Ph进一步将其增至10 kPa，展现优异的力学可调性。

3.8 细胞相容性

含0.5 w/v% Gelatin-Ph的构建体中，10T1/2细胞7天后线粒体活性增长3.1倍，活细胞率超90%，证实墨水优异的生物相容性。

这项研究开创性地证明：通过预混冻干工艺，ChitoNFs-HA复合生物墨水可长期保持纳米纤维分散性和功能完整性。其创新价值体现在三方面：技术上，利用多糖间静电相互作用攻克了纳米纤维冻干聚集难题；应用上，实现"即用型"生物墨水的三个月稳定储存，简化临床转化流程；科学上，首次系统阐明ChitoNFs与HA衍生物的协同稳定机制。特别值得注意的是，该墨水在冻干前后均保持HRP介导的快速凝胶能力，且力学性能可通过组分比例精确调控，为不同组织工程需求提供定制化解决方案。

研究也存在若干待完善之处：如未评估不同长径比ChitoNFs的影响，干细胞等原代细胞的兼容性有待验证。未来研究可探索生长因子整合策略，并开展动物实验评估组织再生效果。尽管如此，这项工作无疑为生物墨水的工业化生产和商业化应用铺平了道路，使"随时打印活体组织"的愿景又向前迈进了一大步。正如作者所言，这项技术将显著简化生物墨水的储存物流，让偏远地区医院也能便捷获取高质量生物墨水，最终造福全球患者。