基于3D-DNA纳米机器与蛋白质纳米孔传感技术的乙型肝炎病毒RNA高灵敏度检测新方法

本研究针对慢性乙型肝炎治疗监测中血清HBV RNA检测的临床需求，开发了一种结合3D-DNA纳米机器信号放大与α-溶血素（α-HL）纳米孔单分子检测的创新方法。研究人员通过设计特异性DNA行走链（Walker Strand）和信号报告链（SR DNA），实现了对HBV RNA的免扩增检测，检测限达12.5 fM。在26例患者和7例健康人样本验证中，与RT-qPCR相比准确率达97%，治疗决策符合率100%，为临床提供了更简便、经济的检测方案。

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球重大公共卫生问题，每年导致约80万人死于相关肝病。尽管现有疫苗能暂时抑制病毒，但准确监测病毒活动仍是临床难题。目前依赖逆转录定量PCR（RT-qPCR）的HBV RNA检测存在操作复杂、设备昂贵等问题，且缺乏标准化方法。更棘手的是，作为金标准指标的肝内共价闭合环状DNA（cccDNA）检测具有侵入性，而血清HBV RNA作为cccDNA转录活性的替代标志物，其检测技术亟需突破。

四川大学华西医院的研究团队在《Molecular Biomedicine》发表的研究中，创新性地融合了3D-DNA纳米机器与蛋白质纳米孔技术。该研究通过设计"保护链-行走链"竞争结合机制，使每个HBV RNA分子触发纳米机器释放大量7核苷酸单链DNA（7-nt ssDNA）信号报告分子，再通过α-溶血素纳米孔对这些超短核酸进行单分子计数，实现了无需扩增的高灵敏度检测。关键技术包括：1）金纳米颗粒（Au NPs）负载的3D-DNA纳米机器构建；2）核酸内切酶Nb.BbvCI介导的信号放大；3）基于"阻塞率（0.5-0.8）-阻塞时间（≤10 ms）"双参数模型的纳米孔信号识别；4）26例患者和7例健康人血清样本的临床验证。

研究原理

研究团队设计了如图1所示的检测体系：

当HBV RNA与保护链（TP）结合后，暴露的行走链可循环切割固定在金纳米颗粒上的SR DNA，每个靶分子可产生约20倍信号放大。

信号识别模型

通过系统优化发现（图3），在pH 4.5缓冲体系和100 mV电压下，7-nt ssDNA呈现独特的阻塞特征（阻塞率0.5-0.8，持续时间≤10 ms），与长链核酸形成显著差异：

这种双参数模型使SR DNA的识别准确率达96%。

纳米机器性能

透射电镜（图4a-b）和紫外光谱证实纳米机器成功构建，每个金纳米颗粒携带约320条SR DNA和17条行走链：

荧光实验显示单个行走链可催化产生19条SR DNA，实现20倍信号放大。

临床验证

在33例样本检测中（图6），该方法与RT-qPCR结果一致性达97%，对18例治疗中患者的继续用药/停药判断完全符合临床诊断：

且能特异性区分HBV与其他肝炎病毒（HAV/HCV/HEV）。

该研究首次将3D-DNA纳米机器与纳米孔传感技术整合应用于病毒RNA检测，其12.5 fM的检测限较荧光法提升1000倍，且避免了PCR扩增带来的污染风险。更重要的是，该方法为临床提供了判断抗病毒治疗时机的客观依据，通过检测血清中源自cccDNA的pgRNA水平，实现了对病毒转录活性的无创评估。虽然存在反应时间较长（2小时）、高通量检测受限等问题，但这项技术为发展便携式诊断设备奠定了基础，也为其他核酸标志物的检测提供了新思路。