糖基化改造提升抗CD4 cys-diabody表达量实现CD4+T细胞的高对比度活体成像

本研究针对抗小鼠CD4 cys-diabody（GK1.5 cDb）表达量低的技术瓶颈，通过CDR移植和N80D糖基化位点突变成功构建新型抗体片段（GK1.5 N80D cDb），表达量提升10-20倍。经89Zr标记的免疫PET证实该改造体在保持CD4抗原特异性的同时，通过消除可变区糖基化恢复典型肾脏清除模式，显著提高淋巴组织靶向性（脾脏摄取达48.5%ID/g），为自身免疫疾病和肿瘤免疫治疗的CD4+T细胞动态监测提供新型分子影像工具。

　　

在免疫学研究领域，CD4⁺T细胞作为免疫系统的"指挥官"，在自身免疫疾病（如类风湿性关节炎、炎症性肠病）和肿瘤免疫治疗中扮演着双重角色。然而，传统外周血检测难以反映组织驻留T细胞的真实状态，而活检又存在侵入性和样本异质性问题。非侵入性、全身体内成像技术成为破解这一难题的关键突破口。

美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）Crump分子影像研究所的研究团队长期致力于抗体片段分子影像探针的开发。前期基于GK1.5杂交瘤构建的抗CD4 cys-diabody（cDb）虽证实可通过⁸⁹Zr标记实现CD4⁺T细胞的免疫PET成像，但0.36 mg/L的极低表达量严重制约其广泛应用。这项发表在《Molecular Imaging and Biology》的研究通过创新性抗体工程技术，成功突破这一生产瓶颈。

研究采用三大关键技术：1）将GK1.5的互补决定区（CDR）移植至高表达的YTS169（抗CD8抗体）框架上；2）通过N80D点突变消除可变区糖基化位点；3）利用马来酰亚胺-去铁胺（mal-DFO）进行位点特异性⁸⁹Zr标记，在免疫健全小鼠模型中进行动态PET/CT成像和离体生物分布分析。

【Re-engineering of GK1.5 Cys-diabody】

通过CDR移植构建的GK1.5 FR cDb表达量提升至4.6-5.6 mg/L，但SDS-PAGE和PNGase F处理证实其存在可变区糖基化。N80D突变体（GK1.5 N80D cDb）分子量降至理论值52.2 kDa，产量稳定在2.8±0.6 mg/L。

【Reengineered GK1.5 N80D cDb Retains Anti-CD4 Antigen Binding Affinity】

ELISA显示GK1.5 N80D cDb保持与亲本GK1.5 IgG相当的亲和力（EC₅₀ 3.0±1.0 nM）。流式细胞术证实其可特异性标记7.8%的脾细胞（与GK1.5 IgG的9.3%相当），且结合在2 μg时即达饱和。

【Site-specific Conjugation of the Chelator mal-DFO】

两种cDb经TCEP还原后与mal-DFO高效结合（每分子0.8-1.0 DFO），SEC显示偶联体保持单体状态，未发生聚集。

【⁸⁹Zr-immunoPET in ImmunocompetentMice】

动态PET显示糖基化体（⁸⁹Zr-GK1.5 FR cDb）主要经肝胆清除，22 h时脾脏摄取20.7%ID/g；而N80D突变体（⁸⁹Zr-GK1.5 N80D cDb）恢复肾脏清除模式，4 h时淋巴结摄取达66.2%ID/g，脾脏摄取提升至48.5%ID/g，阻断实验证实其CD4特异性。

【Ex vivo Biodistribution】

离体数据验证N80D突变体脾脏/血液比达485（糖基化体仅207），肾脏残留>200%ID/g符合预期。阻断组淋巴组织摄取下降4-7倍，证实靶向特异性。

这项研究通过巧妙的抗体工程技术实现三重突破：1）产量提升解决生产瓶颈；2）糖基化改造优化药代动力学；3）保留CD4特异性识别能力。所开发的⁸⁹Zr-GK1.5 N80D cDb具有当天成像、低蛋白剂量（2 μg）和高靶本比等优势，为免疫治疗响应预测、造血干细胞移植后免疫重建评估等研究提供强大工具。未来与¹⁸F标记技术的结合有望进一步降低辐射剂量，实现CD4⁺T细胞的纵向动态监测。该研究不仅为免疫细胞分子影像探针开发提供范式，其CDR移植结合糖基化改造的策略也可拓展至其他抗体片段工程。