通过位点特异性异肽键形成调控抗菌肽Esc(1-21)的活性与结构

这篇研究创新性地通过异肽键(isopeptide bond)修饰策略改造抗菌肽(AMP)Esc(1-21)，在五个不同赖氨酸位点引入非经典肽键，系统评估了其对肽段结构特性、抗菌/抗生物膜活性、细胞毒性及蛋白酶稳定性的影响。其中Esc(1-21)ε20在保持母肽抗菌效力的同时显著降低真核细胞毒性（200μM时存活率提升30%）并增强血浆稳定性（24h残留量达39.6% vs 母肽15.6%），其C端异肽键修饰策略为优化AMP的成药性提供了新思路。

　　

1 引言

在抗生素耐药性危机背景下，源自蛙皮的抗菌肽Esc(1-21)因其独特的膜破坏机制成为传统抗生素替代品。该21肽含5个赖氨酸残基，对革兰阴性菌(E. coli、P. aeruginosa)展现强效抗菌活性，但存在高浓度细胞毒性及蛋白酶敏感性缺陷。研究首次尝试在肽链特定位点（K5/K9/K10/K12/K20）引入异肽键——通过赖氨酸ε-氨基形成的非经典共价键，这种天然存在于HK97噬菌体衣壳等系统的结构可增强蛋白稳定性。

2 材料与方法

采用Fmoc固相合成法制备五种异肽键变体，通过RP-HPLC和TOF-MS验证纯度（>95%）。抗菌活性通过MIC测定，膜渗透性采用Sytox Green荧光探针评估，CD光谱分析脂质体诱导的二级结构变化。人血浆稳定性实验设置6/24h时间点，细胞毒性测试使用HaCaT角质细胞和CCK-8法。

3 结果

3.1 化学特性

异肽键位置显著影响疏水性：ε20变体保留时间最长（22.8min），对应55.6%乙腈洗脱浓度；而中央修饰的ε12疏水性最低（51.98%）。质谱确认所有变体分子量为2184.4Da，净电荷+6。

3.2 生物活性

ε20对P. aeruginosa ATCC 15692的MIC达1.56μM，优于母肽（2μM），且2h处理可使S. epidermidis生物膜活性降低90%。膜渗透实验显示ε20在5μM时即引起显著荧光增强，动力学与母肽相当。引人注目的是，其在200μM时的细胞毒性（65%）显著低于母肽（95%）。

3.3 结构特性

CD光谱揭示关键规律：母肽和ε20在膜环境中形成典型α-螺旋（[θ]_222nm=-12,500 deg·cm²/dmol），而中央修饰的ε9/ε10/ε12几乎无螺旋构象。这解释为何ε12丧失抗菌活性（MIC>50μM）。

3.4 血浆稳定性

异肽键显著延缓降解：24h后ε12和ε20残留量分别为44.95%和39.64%，远超母肽（15.59%）。质谱检测到母肽在K9/K10位点发生蛋白酶切割。

4 讨论

研究证实异肽键位置决定功能输出：C端修饰（ε20）通过维持两亲性螺旋结构保留膜破坏能力，同时因构象扰动降低对真核细胞膜的亲和力；而中央修饰（ε12）因破坏螺旋关键区域导致功能丧失。该策略为平衡AMP活性与安全性提供了新范式——通过精准的骨架工程而非全局修饰实现性能优化。未来可探索异肽键与其他修饰（如D型氨基酸）的协同效应，或开发针对多重耐药菌的杂合肽设计。