基于宏条形码技术解析赤霉病感染与健康大麦籽粒内细菌内生菌群的差异及其与抗病性的关联

这篇研究采用16S rRNA基因测序技术，比较了禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)感染与健康大麦(Hordeum vulgare)籽粒内细菌内生菌群的差异。研究发现赤霉病(FHB)感染和植株生育期显著改变了内生菌群结构，鉴定出与FHB感染(如Kosakonia cowanii)、生理成熟期(如Xanthomonas sp.)和抗性基因型(如Weeksellaceae chryseobacterium)显著相关的细菌扩增子序列变异体(ASVs)。该研究为通过微生物组互作预测和控制赤霉病提供了新见解。

　　

ABSTRACT

内生菌是与植物宿主保持密切关系的生物体，它们适应植物内部组织的生态位并在这种互作中互利共生。植物病害可能改变内生菌群落结构，从而对植物发育和防御机制产生负面影响。赤霉病(FHB)是大麦的一种复杂且具破坏性的病害，可能诱发此类变化。研究FHB感染大麦籽粒的细菌内生菌群落结构，可为疾病发展、植物对FHB的抗性以及内生菌对病原体发育的影响提供有价值的信息。

通过16S rRNA基因扩增子测序比较了禾谷镰刀菌感染和无病条件下大麦籽粒的内生细菌谱。同时测试了微生物组对大麦基因型(FHB中度抗性、中间型或易感)、植株生育期(面团中期与生理成熟期)和年份(2021年与2022年)的响应。研究表明FHB和植株生育期对整体细菌内生微生物组产生显著改变。Xanthomonas spp.主要在大麦籽粒内圈中被检测到。此外，鉴定出与FHB感染样本(ASV0016; Kosakonia cowanii)、生理成熟期(ASV0001; Xanthomonas sp.)和FHB中度抗性基因型(ASV0292; Weeksellaceae chryseobacterium)显著相关的细菌ASVs。观察到细菌ASVs随年份积累。研究发现可用于通过细菌微生物组互作预测诱导或控制宿主中FHB的条件。

1 引言

内生菌是与宿主密切互作的植物相关微生物，常促进植物生长和健康。与植物病原体不同，内生菌在定殖植物内部组织(即内圈)时无症状，因为它们不会诱导宿主防御反应。每种植物都可能含有内生菌。大麦在全球许多地区种植，目前在谷类作物中产量排名第四。大麦是牲畜饲料和啤酒等酒精饮料的主要成分，也可作为食物食用。

每年大麦产量损失估计高达30%，其中病原体仍是主要原因。FHB是大麦最具破坏性和挑战性的病害之一，主要由禾谷镰刀菌引起。其他可能导致FHB的镰刀菌包括F. poae、F. avenaceum和F. culmorum。在大麦中，感染始于开花后和穗出现时，真菌子囊孢子(主要是)或分生孢子落在穗上。萌发的真菌孢子产生菌丝并最终感染大麦穗，降低产量和籽粒质量。此外，受感染的大麦籽粒可能被单端孢霉烯族霉菌毒素(包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON)污染，使籽粒不适合使用。

引入植物病原体后植物的生理和代谢变化可能影响微生物-微生物和微生物-植物的相互作用，导致内生微生物群落谱的变化，特别是在受感染的组织(如籽粒)中。然而，大麦籽粒内生菌尚未受到太多关注，这凸显了了解其在可能有利于或不利于FHB条件下的群落结构和功能的价值。另一方面，植物的原生微生物群(包括内生菌)可能影响病原体的建立和传播。此外，籽粒中的内生菌是幼苗微生物的最初来源，在植物最脆弱的阶段(如种子萌发和幼苗发育)尤为重要。内生菌还可通过籽粒携带，在代际间垂直传递或水平传递到其他生境(如土壤)。

植物微生物组以细菌为主，此前已有短期土壤细菌群落变化的报道，主要由于其高繁殖率和对生态变化的敏感性。因此，由于外部因素如宿主基因型和发育阶段、温度、土壤条件和群落中的其他微生物，细菌内生菌可能会在内圈微生物群落中发生变化/转移。

本研究使用宏条形码技术调查了四个两行春大麦基因型籽粒中的细菌内生菌，这些基因型对FHB的反应从中度抗性(Kutahya[KT]和GB132013[GB])到易感(CDC Bold[BL])不等。AAC Synergy(SN)表现出对FHB的中间抗性，介于中度抗性和易感性之间。四个大麦基因型在两个连续年份(2021和2022)取样，包括在禾谷镰刀菌感染下，取样时间介于面团中期和生理成熟期/收获期之间。将源籽粒(2020年)的细菌内生菌群落与测试年份(2021和2022年)生产的籽粒进行比较，以了解细菌内生菌在连续世代中的分布。假设大麦籽粒中的内生细菌可能与不同的FHB反应相关。

2 材料与方法

2.1 大麦样本

分析了代表四个两行春大麦基因型(对FHB具有不同遗传抗性)在2年(2021和2022)内的内生细菌谱。在距离对照(非禾谷镰刀菌接种)地块至少400米处建立FHB病圃，并用防护带围住，以尽量减少禾谷镰刀菌孢子从感染植株或残茬传播。

将大麦籽粒(发芽率>90%)播种到土壤中3-6厘米深，采用90×30.5厘米(双行)的灌溉小区，每行约40株。FHB病圃中的大麦基因型采用随机完全区组设计，四个重复。按照描述的方法用禾谷镰刀菌的玉米粒接种物接种小区。接种物由代表3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3ADON)和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15ADON)化学型的四个禾谷镰刀菌分离株(50:50)组成。每天两次在06:00和18:00进行灌溉，从初始禾谷镰刀菌接种到成熟开始。FHB病圃于2000年建立，此后通过夏季休耕和耕作在交替年份控制杂草。

非禾谷镰刀菌接种地块(非灌溉)设计为每个大麦基因型三个重复，并保持与接种植株相同的农艺实践。2021和2022年的田地在播种前都进行了秋季和春季耕作，并施用相似总量的肥料。2021年施用农药Refine SG、MCPA 600和Agral 90控制阔叶杂草。2022年施用Infinity、Achieve和Turbocharge控制阔叶和禾本科杂草。所有试验田位于加拿大曼尼托巴省布兰登的加拿大农业和农业食品部布兰登研究与发展中心。田间试验的初始籽粒来自同一地点的各种测试。

2.2 FHB病害评级

为确认禾谷镰刀菌接种田间小区的病害发展，在大麦抽穗后3.5周的面团中期对大麦穗进行FHB目测评级。使用0-5级量表，其中0=无感染；1=低发病率，低严重度；2=低至中度发病率，低至中度严重度；3=中度发病率，中度严重度；4=中至高发病率，中至高严重度和5=高发病率，高严重度。使用基因型和年份作为固定效应、重复作为随机效应的统计模型分析FHB评级数据。使用最小二乘(LS)均值检验预测值之间的对比。

2.3 大麦籽粒中DON浓度的评估

除了FHB的视觉病害严重度评级外，还使用超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UHPLC-HRMS)测量了生理成熟期收获的籽粒中的DON霉菌毒素含量。简要来说，大麦籽粒面粉(1克)用乙腈、甲醇和水的混合溶剂(10毫升)在15毫升聚丙烯锥形离心管中提取。将面粉-溶剂混合物充分混合润湿面粉样品，然后超声处理(30分钟)。样品在垂直旋转摇床上进一步提取90分钟，40转/分钟。将面粉-溶剂混合物离心(6000g，30分钟)，上清液通过注射器过滤器(0.2微米尼龙，15毫米)转移到干净的10毫升平底管中。将5毫升过滤上清液等分转移到干净的40毫升琥珀色玻璃瓶中，使用样品蒸发器蒸发和浓缩。将蒸发的提取物重新悬浮在1毫升含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇/水(70:30体积/体积)溶液中，超声处理和涡旋各5秒。将重新悬浮的提取物转移到琥珀色液相色谱小瓶中进行分析，并在分析前用稳定同位素¹³C₁₅-DON强化。使用UHPLC与HRMS联用分析提取物中的DON。使用反相柱和甲醇与水的梯度洗脱分离DON分析物。根据准确质量(m/z)值使用母离子和碎片离子进行DON的鉴定和确认，同时使用母离子的准确质量进行定量。每个处理计算平均DON含量，使用两到四个重复。当至少一个重复中DON含量<0.001 mg kg^-1时，用其余重复计算平均值的标准误差(SEM)。

2.4 大麦籽粒细菌内生菌群落的宏条形码分析

2.4.1 大麦样本采集

在2021和2022年从禾谷镰刀菌接种和非接种大麦田采集样本。在面团中期(Z85；8月；S2)，手工采摘整株样品，用0.2