具有抗菌和体外生物活性的3D打印镁/纳米金刚石双掺杂羟基磷灰石复合水凝胶，用于骨组织工程

《Journal of the American Ceramic Society》：3D-printed magnesium/nanodiamond dual-doped hydroxyapatite composite hydrogels with antibacterial and in vitro bioactive properties for bone tissue engineering

骨组织工程中开发了一种新型三维打印水凝胶支架，通过结合羧甲基壳聚糖、明胶和镁/纳米金刚石双掺杂羟基磷灰石，显著提升了抗菌性能（对大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑制率90%和95%）、机械强度（弹性模量12.5 kPa，韧性2.1 MJ/m3）和细胞相容性（人骨髓间充质干细胞存活率160%）。该材料兼具优异打印性能、抗菌能力和促进骨再生功能。

　　骨组织再生是个性化医疗领域面临的关键挑战之一，尤其是在对抗细菌感染时，这些感染常常会阻碍正常的愈合过程。尽管已有多种支架系统被开发用于这一领域，但将镁和纳米金刚石双掺杂的羟基磷灰石（MgND-HAp）与天然聚合物结合，并以3D打印形式呈现，实现抗菌保护和增强细胞反应的双重功能，仍是一个未被充分探索的领域。本研究中，我们开发了一种3D打印的水凝胶支架，该支架结合了羧甲基壳聚糖、明胶和MgND-HAp，用于骨组织工程。通过系统优化，我们实现了对支架组成和纳米结构的精确控制，使支架具备了良好的结构、物理化学和生物特性。

首先，研究通过X射线衍射（XRD）确认了MgND-HAp的成功掺杂，同时通过流变学研究展示了随着MgND-HAp浓度的增加，支架的打印性能得到了显著改善。其中，CMG 4%配方表现出最佳的粘弹性（弹性模量约为12.5 kPa）和韧性（2.1 MJ/m3），在不同的MgND-HAp浓度下展现出优异的机械性能。生物相容性研究进一步表明，与对照支架相比，该支架显著提高了人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的细胞活力和迁移能力。此外，随着MgND-HAp浓度的增加，支架对大肠杆菌（90%）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（95%）的抗菌效果也显著增强。结晶紫染色实验进一步验证了所有含有MgND-HAp的配方对生物膜形成具有显著的抑制作用。这些结果表明，所开发的CMG水凝胶支架，特别是CMG 2%和CMG 4%配方，为骨组织工程提供了一个具有优异打印性、机械稳定性、生物相容性和抗菌性能的平台。

为了应对骨缺陷和损伤的日益增长的需求，骨再生研究逐渐成为一种有前景的解决方案。随着全球人口老龄化和骨相关疾病的发生率上升，对创新解决方案的需求尤为迫切。这些方案不仅要促进骨再生，还应调节免疫反应和抗菌性能。羟基磷灰石（HAp）作为天然骨的主要无机成分，因其良好的生物相容性和骨传导性而被广泛用于骨组织工程支架的基材。然而，HAp固有的机械特性，如脆性和强度低，限制了其在临床中的广泛应用。因此，研究人员探索了多种策略，以增强HAp基支架的功能性，包括掺杂生物活性元素和引入纳米颗粒。

镁（Mg）作为一种有前景的掺杂元素，因其在骨代谢中的关键作用、抗菌性能以及促进成骨细胞增殖和分化的潜力而受到关注。Mg2+离子已被证明能够促进骨矿化并调节羟基磷灰石晶体的形成，从而提高HAp支架的机械性能。此外，Mg还表现出免疫调节作用，可能通过调节促炎和抗炎反应之间的平衡，为骨再生创造更有利的环境。纳米金刚石（NDs）则提供了另一种增强骨支架的途径。这些碳基纳米颗粒具有高比表面积、良好的生物相容性以及表面化学可修饰性，能够执行超特异性任务。研究表明，NDs可以促进干细胞的成骨分化并增强骨形成。其sp3碳-晶格结构在体内提供了卓越的硬度和稳定性，同时其表面化学性质可以被调整以实现特定功能。此外，NDs本身具有固有的抗菌性能，可以有效防止生物膜形成，使其在预防术后感染方面具有特别的价值。它们的免疫调节潜力表明，它们能够以独特的方式影响局部免疫环境，从而对骨再生产生积极影响。

将Mg掺杂与NDs引入HAp支架中，为开发具有增强机械性能、生物活性和组织再生能力的多功能纳米结构支架提供了一种新颖的方法。通过系统优化，我们实现了对支架组成和纳米结构的定制化，从而精确控制支架的结构和打印性。对物理化学特性、流变行为和体外生物性能的全面评估突显了这些支架在骨组织工程中的转化潜力。

本研究通过系统的实验方法，验证了CMG水凝胶支架在骨组织工程中的应用潜力。实验中，我们首先合成了MgND-HAp纳米复合材料，并通过湿化学沉淀法进行制备。合成的材料在不同浓度下表现出不同的物理化学特性，其中MgND-HAp的掺杂显著增强了其抗菌性能和生物膜抑制能力。随后，我们通过将MgND-HAp与羧甲基壳聚糖和明胶结合，制备了具有3D打印功能的复合水凝胶。通过调整MgND-HAp的掺杂浓度，我们观察到支架的机械性能和生物活性得到了显著提升。其中，CMG 4%配方表现出最佳的粘弹性（弹性模量约为12.5 kPa）和韧性（2.1 MJ/m3），显示出良好的打印性能和结构稳定性。

在体外研究中，我们使用hBMSCs评估了支架的生物相容性。WST-8检测结果显示，随着MgND-HAp浓度的增加，细胞活力显著提高，其中CMG 4%支架在第7天的细胞活力达到约160%。Live-Dead检测进一步表明，所有配方均表现出良好的细胞存活率，且细胞在支架表面分布均匀。细胞迁移实验显示，CMG 2%和CMG 4%支架的细胞迁移率显著高于对照组，表明这些支架能够有效支持细胞的迁移和组织再生过程。此外，荧光显微镜下的图像分析也证实了细胞的附着和增殖情况，进一步说明了支架的生物活性。

在抗菌性能测试中，我们通过菌落计数法和生物膜抑制实验评估了支架的抗菌效果。结果表明，随着MgND-HAp浓度的增加，支架对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（包括耐甲氧西林菌株）的抗菌效果显著增强。特别是，CMG 4%支架对这两种细菌的杀灭效率分别达到了90%和95%。结晶紫染色实验进一步确认了所有含有MgND-HAp的配方在生物膜形成方面的显著抑制作用。这些结果表明，MgND-HAp的引入不仅提升了支架的抗菌能力，还显著降低了生物膜的形成风险，这对于骨组织工程中的感染防控具有重要意义。

此外，流变学分析显示，随着MgND-HAp浓度的增加，支架的粘弹性特性得到了显著改善。特别是，CMG 4%配方在不同的角频率和剪切速率下表现出良好的剪切变稀行为，表明其在3D打印过程中的适应性更强。这些性能的提升可以归因于MgND-HAp与聚合物基质之间的强相互作用，如氢键和离子相互作用，从而增强了支架的结构稳定性和机械强度。

在物理化学特性分析中，FTIR和XRD等技术被用于评估支架的化学组成和晶体结构。FTIR谱图显示，随着MgND-HAp浓度的增加，支架中磷酸盐（PO?3?）的吸收峰逐渐增强，表明HAp的成功掺杂。XRD分析进一步验证了支架的晶体结构，并确认了MgND-HAp在不同浓度下的存在。这些结果表明，支架的物理化学特性在MgND-HAp的掺杂下得到了优化，从而提高了其在骨组织再生中的应用潜力。

支架的制备过程涉及系统的优化策略，包括MgND-HAp的掺杂比例和打印参数的调整。通过精确控制这些因素，我们成功制备了具有不同MgND-HAp浓度的CMG水凝胶支架，并评估了其在不同条件下的打印性能。结果表明，CMG 4%支架在打印过程中表现出最佳的结构完整性和机械性能，使其成为骨组织工程中理想的材料选择。此外，支架的表面结构和孔隙率也得到了优化，从而提高了细胞与支架的相互作用能力。

在细胞迁移和增殖的评估中，我们发现，随着MgND-HAp浓度的增加，细胞的迁移率和增殖能力显著提高。特别是，CMG 4%支架在48小时内表现出最显著的细胞迁移和分布，表明其能够有效支持细胞的扩散和组织形成。这些性能的提升不仅有助于细胞在支架上的附着和生长，还为组织再生提供了必要的物理和化学环境。

最后，我们通过统计分析确认了支架在不同参数下的性能差异。所有实验均采用单因素方差分析（ANOVA）进行评估，并通过Origin Pro 2025软件进行数据处理。结果表明，不同浓度的MgND-HAp对支架的机械性能、生物相容性和抗菌能力具有显著影响。这些发现为开发具有多功能性的骨组织工程支架提供了重要的理论依据和实验支持。

综上所述，本研究成功开发了一种结合MgND-HAp、羧甲基壳聚糖和明胶的3D打印水凝胶支架，该支架在骨组织再生中表现出优异的性能。通过系统的优化和评估，我们不仅提高了支架的机械强度和韧性，还显著增强了其抗菌和生物膜抑制能力。这些特性使CMG 4%支架成为骨组织工程中最具潜力的候选材料之一，有望在个性化医疗领域发挥重要作用。未来的研究应进一步探索这些支架在体内外环境中的长期稳定性和降解特性，以推动其在临床应用中的转化。