丝状真菌黑曲霉工程化生产羟化胶原蛋白的突破性研究

本研究针对动物源胶原蛋白存在病毒污染风险的问题，开发了基于黑曲霉(Aspergillus niger)的异源表达系统。研究人员通过模块化克隆构建胶原表达盒，结合蛋白酶缺陷株改造和培养基优化，首次实现真菌系统生产部分羟化的重组胶原III型(5 mgL-1)。该成果为组织工程和创伤修复提供了安全可控的病毒-free胶原来源，具有重要转化医学价值。

　　

胶原蛋白作为脊椎动物最丰富的结构蛋白，在组织工程和创伤修复领域具有不可替代的作用。然而传统动物源胶原存在两大痛点：难以完全去除的动物病毒污染风险，以及可能引发免疫排斥反应的异种蛋白修饰。随着3D生物打印和创面修复技术的快速发展，市场对"清洁"胶原的需求激增——据文献显示，2020年全球胶原市场规模已达47亿美元，但现有重组生产系统面临产量低、成本高、翻译后修饰不完善等瓶颈。

德国柏林工业大学(Technische Universit?t Berlin)生物技术研究所的应用与分子微生物学团队另辟蹊径，选择具有"多用途细胞工厂"之称的黑曲霉作为表达宿主。这种丝状真菌不仅具有强大的蛋白分泌能力(>30 gL^-1)，其内源性翻译后修饰系统还能实现脯氨酸羟基化等关键修饰。研究通过模块化克隆技术(MoClo)构建了包含12种转录单元的分子工具库，创新性地采用P2A序列实现胶原III型(COL3A1)与报告基因的共表达，并引入病毒/植物/人源三种脯氨酰-4-羟化酶(P4H)变体。通过CRISPR/Cas12a基因编辑技术构建蛋白酶缺陷株，结合氮源抑制培养基优化，最终使重组胶原产量提升至5 mgL^-1，LC-MS证实其实现了16%的脯氨酸羟化率。

关键技术包括：1) 模块化克隆构建多基因表达系统；2) CRISPR/Cas12a介导的protA内肽酶基因敲除；3) 基于HiBiT标签的微量蛋白检测；4) 转录组分析指导代谢工程改造；5) 质谱验证羟化修饰位点。

【Construction of a suite of collagen expressing cassettes using modular cloning】

研究团队设计了三层次模块化载体系统：Level 0包含启动子、分泌信号等基本元件；Level 1整合为完整转录单元；Level 2组装成多基因构件。特别引入Tet-on诱导型启动子控制胶原表达，通过P2A序列连接荧光素酶报告基因，创建了TM4.2等系列工程菌株。荧光显微镜观察显示eGFP标记的胶原定位于菌丝顶端的囊泡结构中。

【Luciferase assay and fluorescent microscopy confirm collagen III expression in A. niger】

利用P2A序列的核糖体跳过机制，通过荧光素酶活性证实胶原转录效率。数据显示病毒P4H变体(TM6.1株)的表达量最高，发光强度达对照组的8倍。eGFP标记实验则直观展示了胶原在胞内的翻译过程，发现其富集于高尔基体后区室。

【Hydroxylated collagen is detectable in the supernatant of an A. niger protease-deficient mutant】

蛋白酶缺陷株TM4.2.1的培养上清中检测到17 kDa特征条带，质谱鉴定出覆盖38%胶原序列的肽段，其中Gly-X-Y重复序列中的Y位脯氨酸呈现部分羟基化。对比野生型，prtT突变使主要蛋白酶Aspergillopepsin A的表达完全消失。

【Media nitrogen source optimization reduces extracellular degradation of recombinant collagen】

氮代谢阻遏实验显示，铵盐培养基使胶原降解率降低至12%(硝酸盐培养基为46%)。这种氮源抑制策略显著减少了胞外蛋白酶活性，为后续工艺放大奠定了基础。

【Reconfiguring expression systems for constitutive HiBiT tagged collagen III production】

将诱导型系统改造为组成型表达，筛选发现tef1启动子与pgxA分泌信号组合(TM30.4株)效果最佳。HiBiT标签的应用使检测灵敏度达到皮摩尔级，克服了低浓度胶原的定量难题。

【Comparative transcriptomic analyses show increased expression of the endopeptidase gene protA during collagen expression】

转录组分析揭示213个基因显著上调，包括液泡蛋白分选相关基因。最突出的是protease A(protA)基因表达量提升4倍，该内肽酶对富含脯氨酸的胶原具有特异性切割活性，这直接指导了后续的基因敲除策略。

【ΔprotA isolate TM44.2 secreted partially hydroxylated recombinant collagen】

最终获得的TM44.2工程菌在优化培养基中稳定分泌30 kDa胶原蛋白达66小时，产量提升至5 mgL^-1。质谱分析证实其羟化模式虽未达天然水平，但已具备典型Gly-X-Hyp结构特征，且病毒源P4H的催化效率优于植物和人源变体。

这项研究开创性地证明了丝状真菌系统生产医用胶原的可行性，其突破性体现在三个方面：首先，模块化克隆策略构建的分子工具库为真菌合成生物学提供了标准化元件；其次，发现protA是胶原降解的关键酶，这一发现为后续改造指明了方向；最重要的是，证实黑曲霉能完成胶原特异的脯氨酸羟化修饰，这对维持胶原三螺旋结构至关重要。尽管当前产量距工业化要求仍有差距，但该研究为开发非动物源胶原产品奠定了关键技术基础，未来通过发酵工艺优化和更多基因编辑，有望使这一系统成为生物医学材料的绿色制造平台。