印度蜜蜂泰国囊状幼虫病毒(TSBV)现场快速检测：基于等温扩增技术的比色法开发与应用

为解决泰国囊状幼虫病毒(TSBV)在印度蜜蜂(Apis cerana F.)中早期诊断难题，ICAR-NBAIR团队开发了RT-PCR、RT-LAMP和RT-RPA三种分子检测技术。研究通过靶向多聚蛋白基因保守区，实现最低50 fg/μL的检测限，其中RT-RPA在39℃下30分钟即可完成检测，为养蜂业提供了无需精密仪器的现场诊断方案。该成果发表于《Journal of Agriculture and Food Research》，对遏制TSBV疫情传播具有重要意义。

　　

在亚洲养蜂业中，泰国囊状幼虫病毒(Thai Sacbrood Virus, TSBV)如同无形的杀手，每年造成超过95%的蜂群损失。这种直径仅31.8纳米的球形病毒专性感染东方蜜蜂(Apis cerana)，其症状与细菌性幼虫病极为相似，使得传统诊断方法束手无策。更棘手的是，病毒在感染初期载量极低，常规电子显微镜和血清学检测难以捕捉，等蜂农发现幼虫出现特征性"囊状"病变时，往往为时已晚。

面对这一困境，印度农业昆虫资源国家局基因组资源部的研究团队展开攻关。他们深知，要阻断病毒传播链，必须开发出如同"病毒雷达"般的精准检测工具——既要能在田间快速识别，又要媲美实验室的灵敏度。这项创新研究最终发表于《Journal of Agriculture and Food Research》，为养蜂业带来了突破性解决方案。

研究人员首先从印度西高止山脉9个养蜂区采集典型病样，通过透射电镜确认病毒形态特征。关键技术路线包含：1) 全基因组比对锁定多聚蛋白基因保守区；2) 设计特异性引物建立RT-PCR(497 bp)、RT-LAMP(羟基萘酚蓝显色)和RT-RPA(SYBR Green I荧光)三套检测体系；3) 使用90份田间样本验证诊断效能。

电子显微镜观察

透射电镜(TEM)显示典型30 nm球形病毒颗粒，扫描电镜(SEM)则揭示染病幼虫表皮出现褶皱、变薄等特征性病变，与健康幼虫光滑表皮形成鲜明对比。

分子检测体系优化

RT-PCR虽能特异性扩增，但需要500 fg/μL的检测限和热循环仪。而创新性的RT-LAMP通过镁离子介导的羟基萘酚蓝显色，将灵敏度提升10倍至50 fg/μL，但65℃温控要求仍限制其田间应用。最亮眼的当属RT-RPA技术——在模拟体温的39℃环境下，仅需30分钟即完成扩增，配合SYBR Green I染料，阳性样本呈现醒目的亮绿色荧光，灵敏度与RT-LAMP相当，却更适应野外环境。

田间验证与系统进化

对90份田间样本的盲测显示，RT-RPA特异性达93.8%，灵敏度高达99.6%。系统发育分析揭示印度TSBV株系与东南亚毒株亲缘最近，但Dakshina Kannada地区的NBAIR_TSBV-T1分离株表现出独特遗传变异，暗示可能存在地域性进化分支。

这项研究开创性地将等温扩增技术应用于印度TSBV检测领域。特别是RT-RPA方案，其三大优势令人瞩目：1) 突破性采用环境温度(39℃)反应，理论上可用体热孵育；2) 检测速度较传统PCR提升6倍；3) 结果判读无需复杂设备，紫外灯下颜色变化一目了然。这为资源匮乏地区的蜂农提供了"口袋实验室"级解决方案。

展望未来，虽然当前方法仍需解决常温下试剂稳定性等挑战，但研究者指出，若结合CRISPR/Cas12a等新型核酸识别系统，有望开发出更精准的现场诊断试纸条。这项成果不仅为保护传粉昆虫生物多样性提供技术支撑，其建立的检测框架还可拓展至其他蜜蜂病毒诊断，具有广阔的产业化应用前景。