蜘蛛毒液中新型DRH折叠肽选择性阻断Shaker型钾通道的发现及其结构功能研究

本研究针对蜘蛛毒液中缺乏高效选择性Shaker型(Kv1)钾通道抑制剂的科学空白，从非洲橙巴布蜘蛛(Pterinochilus murinus)毒液中分离出新型murinotoxins(MnTx-1/2)。通过多组学技术解析其独特的"二硫键约束发夹"(DRH)折叠结构，揭示其通过孔道阻滞机制以纳摩尔级效力特异性抑制Kv1.1/Kv1.6亚型，为离子通道调控提供了全新分子工具，并为药物设计开发了创新支架。

　　

在自然界"军备竞赛"的驱动下，蜘蛛毒液进化出了大量靶向离子通道的精密分子武器。然而长期以来，科学家们发现蜘蛛毒素主要作用于电压感受域，通过"门控修饰"机制影响Kv2/Kv4钾通道，而对Shaker型(Kv1)通道的抑制作用始终未见报道。这一现象引发了学术界对蜘蛛毒素作用机制特异性的思考：是进化选择导致的功能偏倚，还是研究方法局限造成的遗漏？俄罗斯科学院生物有机化学研究所Shemyakin-Ovchinnikov研究所的研究团队通过系统研究，在非洲橙巴布蜘蛛毒液中发现了颠覆认知的新型毒素，相关成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》。

为揭示蜘蛛毒液的未知活性成分，研究人员采用功能导向的分馏策略结合电生理筛选技术。通过RP-HPLC分离毒液组分，利用双电极电压钳技术检测各组分对多种钾通道亚型的抑制活性。活性组分经质谱测序和纳米孔转录组学解析全长序列，通过大肠杆菌表达系统获得重组毒素。运用700 MHz核磁共振仪解析溶液结构，采用SyncroPatch 384PE全自动膜片钳系统进行药理学表征。

Purification of active compounds

从5μL粗毒液中分离出6个组分，其中组分I对Shaker-IR和Kv1.1/Kv1.6表现出显著抑制活性(抑制率40-100%)。经二级纯化获得MnTx-1(3851.7 Da)和MnTx-2(3913.7 Da)，纯度>98%。

Sequencing murinotoxins

Edman降解结合质谱分析发现毒素含6个半胱氨酸。通过Illumina短读长和Oxford Nanopore长读长测序技术组装毒腺转录组，鉴定出含35个氨基酸的前体蛋白序列，成熟肽含3个差异残基。

Production of recombinant MnTx-1

将MnTx-1基因克隆至pET-32bM/L载体，在E. coli SHuffle T7 Express中表达Trx融合蛋白。CNBr切割后经RP-HPLC纯化，复性获得正确折叠的重组肽，与天然毒素共洗脱验证结构一致性。

Spatial structure of MnTx-1

NMR解析显示其采用新颖的DRH折叠：C^I-C^IV、C^II-C^VI和C^III-C^V二硫键连接方式，形成不同于经典ICK(抑制性胱氨酸结)的拓扑结构。分子表面呈现两亲性特征，含疏水簇(I4/W9/P11/A14/P15)和正电荷富集区。

MnTx-1 inhibits Kv1-mediated potassium currents

全自动膜片钳显示MnTx-1对Kv1.1(IC₅₀=1.1 nM)和Kv1.6(IC₅₀=4.4 nM)具有纳摩尔级抑制活性，对Kv1.2(171 nM)和Kv1.3(381 nM)敏感性较低，而对Kv2-4、Nav1.7/1.8无显著影响。

MnTx-1 interacts with the pore of Kv1 channels

快速可逆的抑制作用符合孔道阻滞特征。Kv1.2-V381R突变体(模拟Kv1.5的R451)几乎完全丧失敏感性，证实V381位于毒素结合的关键位点。电导-电压关系分析显示毒素不改变通道激活特性，呈现状态依赖性阻滞。

这项研究打破了"蜘蛛毒素仅通过电压感受域调控钾通道"的传统认知，首次报道了具有孔道阻滞功能的蜘蛛毒素。其独特的DRH折叠为蛋白质工程提供了新支架，对理解离子通道调控的分子多样性具有重要意义。MnTx-1对Kv1.1/Kv1.6的高选择性和强效抑制，为开发神经系统疾病治疗药物提供了先导化合物。该发现不仅拓展了天然毒素的结构功能图谱，也为蜘蛛毒液的生物医学应用开辟了新方向。