结核分枝杆菌蛋白甘露糖基转移酶的结构解析揭示细菌中WW样蛋白基序的进化与功能意义

本研究揭示了结核分枝杆菌蛋白-O-甘露糖基转移酶(MtPMT)的结构功能关系，为解决结核病治疗中靶向病原体毒力因子的难题提供了新思路。研究人员通过AlphaFold建模和体内外功能实验，首次在细菌中发现WW样结构域介导的脯氨酸富集肽识别机制，证实该酶活性可通过小分子化学补偿调控，为开发选择性抗结核药物奠定基础。

　　

结核病作为全球最致命的传染病之一，其病原体结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)的耐药性问题日益严峻。传统抗生素靶向细菌生存必需机制的策略面临挑战，而针对毒力因子的"非传统"治疗路径成为研究热点。蛋白-O-甘露糖基化(Protein-O-mannosylation, POM)这一保守的翻译后修饰过程，在Mtb感染过程中扮演关键角色。前期研究表明，Mtb中催化POM的单一酶MtPMT是决定病原体感染性和毒力的核心因子，但该酶的三维结构及其底物选择机制长期未明，阻碍了靶向药物的开发。

法国国家科学研究中心(CNRS)的研究团队在《Communications Biology》发表的研究中，综合运用AlphaFold 3建模、荧光标记显微成像、位点定向诱变和微量热泳动等技术，系统解析了MtPMT的结构功能特征。研究发现，尽管与真核生物PMTs存在显著结构差异，MtPMT通过保守的D74/D176/R441/Y444催化中心实现甘露糖转移活性。更引人注目的是，首次在细菌中发现EL4Cter结构域具有类似真核WW结构域的功能特征，其特有的芳香族氨基酸"摇篮"和β-折叠发夹结构选择性识别脯氨酸富集糖基化位点。

关键技术方法包括：1) 构建mCherry/PhoA报告基因融合系统验证膜拓扑结构；2) 基于ConA的酶联凝集素测定(ELLA)定量糖基化水平；3) 完整蛋白高分辨质谱(HR-MS)分析FasCHis糖型；4) 圆二色谱和核磁共振解析EL4Cter*肽段构象；5) 等温滴定量热法(ITC)检测肽段相互作用。

预测模型验证MtPMT膜拓扑结构

通过AlphaFold 3建模与酵母PMTs结构比对，确认MtPMT具有11个跨膜螺旋(TMHs)的GT-C家族典型架构。嵌合体实验证实其N端位于胞质、C端伸向周质的跨膜取向，

为后续功能研究奠定基础。

催化中心关键残基的功能验证

系统突变分析揭示D74作为催化碱基激活苏氨酸羟基，D176作为质子供体协助脂质磷酸基团解离，而R441和Y444通过电荷/疏水相互作用稳定底物。尤为重要的是，R441A突变体活性可通过胍类小分子化学补偿恢复25%，

证明该酶活性位点具有可靶向性。

WW样结构域的发现与验证

序列分析发现Mtb甘露糖蛋白中脯氨酸在糖基化位点邻近区域显著富集。结构预测显示EL4Cter结构域含有P359-W362-Y371-P396特征序列，与真核WW结构域核心基序高度相似。功能实验证实W362A或P396A突变导致酶活完全丧失，而Y371F保守突变保留活性，符合WW结构域功能特征。

底物识别机制解析

分离的EL4Cter肽段虽在溶液中呈随机卷曲，但能特异性结合Mtb Apa抗原的脯氨酸富集肽(P40-54)，而对照肽Apa2(不含脯氨酸)无相互作用。化合物Z95可竞争性结合EL4Cter*，解释其体内抑制效应，为开发竞争性抑制剂提供模板。

该研究首次在原核生物中发现功能性WW样结构域，提出细菌与真核PMTs可能通过趋同进化获得类似底物识别机制的重要假设。从转化医学角度看，阐明MtPMT依赖脯氨酸富集序列的独特识别模式，为设计不影响人类POMTs的选择性抑制剂开辟新途径。通过建立酶活性化学补偿体系，证实靶向该酶的可行性，为开发抗结核"减毒"药物提供了理论依据和实验平台。这些发现不仅拓展了对蛋白质糖基化进化机制的认识，也为应对结核病这一全球健康挑战提供了创新策略。