基于DNA与RNA探针的捕获式线粒体DNA测序技术比较研究：提升基因组学与诊断精准性的关键突破

本研究针对线粒体DNA(mtDNA)测序中DNA与RNA探针性能差异不明确的问题，通过系统优化杂交条件并比较两种探针在组织与血浆样本中的表现。研究发现RNA探针具有更高的mtDNA富集效率，而DNA探针能更有效减少核线粒体DNA片段(NUMTs)导致的假阳性。该成果为精准选择探针提供了科学依据，对癌症诊断和衰老研究具有重要意义。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其独特的环状DNA(mtDNA)蕴藏着生命演化和疾病发生的关键密码。然而在科研和临床检测中，科学家们长期面临一个棘手难题：使用DNA还是RNA探针进行捕获式测序？这两种技术虽被广泛采用，但其性能差异却像"黑箱"般未被系统揭示。更令人担忧的是，核基因组中潜伏的"模仿者"——核线粒体DNA片段(NUMTs)，常常干扰检测结果，导致假阳性。这些问题严重制约了线粒体基因组学在癌症早筛、遗传病诊断等领域的应用。

针对这一技术瓶颈，第四军医大学西京医院的研究团队在《BMC Biology》发表了一项开创性研究。研究人员设计了一套严密的实验方案：首先从肝癌患者的新鲜组织和血浆样本中提取DNA，分别使用定制设计的双链DNA和RNA探针进行捕获测序(NGS)，通过优化杂交温度(55-65°C)和探针用量(4-20ng)建立最佳条件。关键技术包括：1)超声片段化(300-500bp)和文库构建；2)双探针液相杂交捕获；3)生物信息学分析流程(比对rCRS参考基因组、NUMTs过滤等)；4)片段组学特征分析(5'端碱基偏好性、motif多样性评分等)。

不同捕获策略对mtDNA富集的影响

在最优条件下，RNA探针展现出显著优势：组织样本中mtDNA作图率高达92.55%，远超DNA探针的63.18%(P<0.0001)。这种差异源于RNA-DNA杂交体更强的稳定性，特别是在高GC含量区域。但随之而来的是非特异性捕获问题——RNA探针数据中NUMTs来源的reads比例显著升高(组织样本：0.4768 vs 0.2677 CV值)。

DNA探针有效降低NUMTs假阳性

在突变检测方面，DNA探针表现出独特价值。对于等位基因频率(VAF)>1%的突变，两种探针检测结果高度一致(r=1.0000)；但对低频突变(0.1%-1%)，RNA探针数据中NUMTs假阳性频率显著更高(P<0.0001)。值得注意的是，血浆样本的NUMTs干扰尤为严重，这与循环游离mtDNA(ccf-mtDNA)的低拷贝数特性直接相关。

片段组学特征的探针依赖性

RNA探针捕获的mtDNA片段呈现更广的尺寸分布，尤其在4314和7543坐标处存在显著长片段富集峰(片段长度P<0.0001)。而5'端碱基偏好性和motif多样性评分(MDS)等指标则不受探针类型影响，表明这些特征具有生物学本质性。

这项研究首次系统阐明了DNA与RNA探针在线粒体基因组学研究中的性能差异图谱。其重要意义体现在三方面：1)为临床检测提供选择标准——高灵敏度场景优选RNA探针，低频突变检测则需DNA探针；2)揭示血浆样本中NUMTs干扰的分子机制，为液体活检技术优化指明方向；3)建立的片段组学分析方法为癌症早诊提供了新思路。正如通讯作者Jinliang Xing强调的："这项成果就像给线粒体研究领域提供了一本探针使用说明书，让科学家们能根据具体需求做出精准选择。"该研究不仅解决了技术选择的困惑，更将推动线粒体医学向精准化方向迈进。