揭示clusterin分子伴侣功能的结构基础：阿尔茨海默病治疗新靶点的发现

本研究通过解析人源clusterin(Clu)的晶体结构，揭示了其独特的三域构象和两个疏水性尾段的关键作用。研究人员发现Clu通过类似小热休克蛋白的机制抑制Aβ、tau和α-synuclein聚集，同时参与脂蛋白颗粒形成和受体介导的内吞作用。这项发表于《Nature Structural & Molecular Biology》的研究为理解Clu在细胞外蛋白稳态维持中的多功能性提供了结构基础，并为神经退行性疾病的治疗策略开发提供了新思路。

　　

在神经退行性疾病研究领域，细胞外蛋白稳态的失调一直是科学家们关注的焦点。作为细胞外空间的重要"清洁工"，clusterin(Clu，又称载脂蛋白J/ApoJ)在血液和脑脊液中含量丰富，但其精确的作用机制却长期笼罩在迷雾中。更令人困惑的是，CLU基因的某些等位基因已被确认为晚发型阿尔茨海默病(AD)最重要的遗传风险因素之一，这使解密Clu的工作机制显得尤为迫切。

马克斯·普朗克生物化学研究所(Max Planck Institute of Biochemistry)的研究团队迎难而上，通过解析人源Clu的晶体结构，揭开了这一多功能蛋白的神秘面纱。研究发现，Clu具有不连续的三域结构：卷曲螺旋(CC)结构域、含所有二硫键的小螺旋结构域(DD)和C端α/β卷状(AB)结构域。但最令人惊讶的是，两个由前体蛋白切割产生的无序疏水尾段——β尾和α尾，被发现是Clu多种功能的关键所在。

为阐明Clu的作用机制，研究人员采用了多项关键技术：X射线晶体学解析Clu-Δ(214-238)突变体结构；氢氘交换质谱(H/DX-MS)验证结构模型；圆二色谱(CD)分析蛋白稳定性；硫黄素T(ThT)荧光检测Aβ(1-42)聚集；流式细胞术分析细胞摄取；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定与VLDLR受体的结合；负染电镜观察脂蛋白颗粒形态等。研究还使用了诱导多能干细胞(iPS)分化的神经元进行功能验证。

Structural analyses define the molecular basis of clusterin chaperone function

研究首先展示了人Clu的晶体结构。通过设计删除214-238位氨基酸的Clu-Δ(214-238)突变体，研究人员获得了分辨率为2.8?和3.5?的两种晶型。结构分析揭示Clu具有三个结构域：由β链的α2、α6和α链的α10螺旋组成的CC结构域；包含所有5个二硫键的DD结构域；以及由三股反平行β片层包裹α12螺旋构成的AB结构域。值得注意的是，野生型Clu中被弗林蛋白酶切割产生的β尾(204-227位)和α尾(228-238位)在突变体中被删除，这部分区域在结构中呈现高度柔性。

Structural basis of chaperone function

在分子伴侣功能研究中，Clu表现出显著的pH依赖性。在pH7.2条件下，Clu能有效抑制变性硫氰酸酶(Rho)的聚集，形成约700kDa的可溶性复合物；而在pH5.2条件下，这种"holdase"活性明显减弱。通过系统突变分析，研究人员发现删除疏水尾段的TL1突变体几乎完全丧失了抑制Rho聚集的能力，而仅改变尾段疏水氨基酸的TL2和TL3突变体则表现出剂量依赖性的活性降低。在抑制Aβ(1-42)纤维形成实验中，野生型Clu在1:300的摩尔比下能将聚集半衰期从1.3小时延长至4小时，而TL1突变体几乎完全失效。引人注目的是，DD1突变体表现出超常活性，将聚集半衰期延长至12小时以上。将Clu尾段移植到GFP上的实验进一步证实，只有同时包含β尾和α尾的GFP-TL才能模拟Clu抑制Aβ聚集的活性。

Role of flexible tails in Clu uptake

在细胞摄取研究中，荧光标记的Clu(Clu-A488)被证明能与Aβ聚集体协同促进神经元内化。TL1、TL2和TL2+3突变体的摄取效率仅为野生型的15-37%，表明疏水尾段对受体介导的内吞同样关键。通过VLDLR胞外域(VLDLR-ed)结合实验，研究人员测得野生型Clu的KD值为80nM，而TL1、TL2和TL2+3突变体的结合显著减弱。GFP-TL也表现出与VLDLR-ed的明显相互作用，证实尾段直接参与受体识别。

Formation of Clu-phospholipid particles

在脂蛋白形成研究中，Clu与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)在临界摩尔比1:500以上形成19-26nm的纳米盘结构。令人惊讶的是，这些脂蛋白复合物几乎完全保留了抑制Rho聚集和延迟Aβ纤维形成的活性。通过有限蛋白酶解和质谱分析，研究人员发现即使在脂质结合状态下，Clu的β尾仍保持溶剂可及性。TL1、TL2和TL3突变体的脂质结合能力降低80-90%，而删除α7螺旋的CC1突变体则完全丧失该功能，表明疏水尾段与两亲性螺旋α7协同介导脂蛋白颗粒形成。

这项研究首次在原子水平揭示了Clu的三维结构，阐明了其通过柔性疏水尾段实现的多功能机制。这些尾段在序列组成上与小热休克蛋白(sHsp)的N端结构域相似，提示了分子伴侣功能的趋同进化。研究发现不仅为理解Clu在细胞外蛋白质量控制中的作用提供了框架，也为开发针对神经退行性疾病的新策略指明了方向。特别是DD1突变体的超强Aβ抑制活性，展现出工程化Clu变体在AD治疗中的潜在应用价值。此外，Clu在脂蛋白颗粒中保持活性的发现，扩展了我们对循环系统中蛋白稳态维持机制的认识。这项发表于《Nature Structural & Molecular Biology》的研究，无疑将为神经退行性疾病领域带来深远影响。