基于代谢条形码技术的狼饮食定量分析研究：阻断引物干扰下的精确饮食组成评估

本研究针对野生动物饮食研究中代谢条形码(Metabarcoding)技术的定量准确性难题，西班牙巴斯克大学(UPV/EHU)团队通过饲喂实验，系统评估了阻断引物(blocking primer)对狼(Canis lupus)粪便样本中相对读长丰度(RRA)的影响。研究发现RRA能高度准确反映饮食组成(P<0.001; R2=0.815)，最佳结果出现在未使用阻断引物时，而阻断引物虽增加饮食读长比例却降低了检测准确性。该研究为顶级捕食者的饮食定量研究提供了重要方法学参考，发表于《Scientific Reports》。

　　

在生态学研究中，准确了解动物饮食组成是理解物种共存、营养级联效应和生态系统功能的关键。然而传统形态学分析方法存在鉴定分辨率低、定量困难等局限。虽然DNA代谢条形码(Metabarcoding)技术通过高通量测序显著提高了食物残渣的物种鉴定能力，但其定量准确性一直备受争议——特别是当捕食者与猎物亲缘关系接近时，阻断引物(blocking primer)的使用是否会干扰相对读长丰度(RRA)的定量效果，成为亟待解决的方法学难题。

针对这一科学问题，西班牙巴斯克大学(UPV/EHU)的研究团队设计了一项创新的饲喂实验。研究人员选取伊比利亚狼(Canis lupus signatus)作为模式物种，精心配制了6种不同组成的饮食方案，包含9种脊椎动物肉类(从5%到80%不等比例)。通过为期42天的控制实验，收集50份粪便样本，分别采用0×、5×、10×、15×和20×浓度的狼特异性阻断引物进行处理，使用12SV05标记进行PCR扩增，并在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序。

关键技术方法包括：(1)设计六种不同肉类配比的饮食方案；(2)采用无菌采样和DNA提取技术处理粪便样本；(3)应用不同浓度阻断引物进行对比实验；(4)使用12S rRNA基因引物进行扩增；(5)Illumina平台测序和生物信息学分析；(6)建立GLMM模型评估RRA与实际饮食组成的相关性。

研究结果部分呈现了多项重要发现：

"DNA提取和测序"显示，无阻断引物条件下提取空白对照仅检出狼DNA，证实实验无污染。饮食DNA覆盖度达156-13,500 reads/样本，满足分析要求。

"阻断引物对饮食读长丰度的影响"通过GLM分析证实，阻断引物显著增加饮食读长比例(从5.58%增至34.45%)，但呈现阈值效应，超过10×浓度后增长趋缓。

"饮食成分检测数量"分析表明，阻断引物并未提高主要饮食成分(≥5%)的检出率，所有样本平均检出率达97.8%。

"粪便样本的时间窗口"研究发现平均反映1.73天的饮食摄入，阻断引物虽增加时间标记检出但未延长实际时间窗口。

"DNA代谢条形码的准确性"核心结果显示，无阻断引物时GLMM模型解释81.5%变异(R²_con=0.815)，固定因素(实际饮食比例)解释73.4%。阻断引物使R²降低至0.692-0.775，且物种特异性偏差增大。

"样本量与准确性关系"通过重采样分析发现，样本量超过35份后饮食估计精度趋于稳定。

这项研究得出三个重要结论：首先，代谢条形码技术能高度准确反映狼的饮食组成，最佳定量效果出现在不使用阻断引物时；其次，阻断引物虽增加饮食读长比例(达34.45%)，但同时提高了错误检出率(从0.5项/样本增至>1项)；最后，研究建议野外调查应确保≥30份样本以保证估计精度。这些发现为大型食肉动物的饮食生态学研究提供了关键方法学指导，特别是在处理亲缘关系接近的捕食者-猎物系统时，需谨慎评估阻断引物的使用必要性。该研究同时指出未来需关注野生条件下复杂饮食(含骨骼、毛发等组织)对定量结果的影响，以及不同引物对多样化猎物的扩增偏差问题。