综述：神经精神研究中测序技术的实用指南

这篇综述为神经精神研究领域的测序技术提供了全面指导，涵盖了从传统qPCR到单细胞测序（scRNA-seq/snRNA-seq）、空间转录组（MERFISH/Xenium）、表观遗传分析（ATAC-seq/ChIP-seq）等前沿技术。文章系统比较了各类技术的优缺点，强调应根据研究问题（如细胞异质性、基因调控网络或神经发育疾病）选择合适方法，并详细探讨了实验设计、数据分析和验证策略，为解析大脑复杂分子机制提供了实用框架。

　　

靶向基因分析：半定量聚合酶链反应（qPCR）

作为经典技术，qPCR通过特异性引物扩增目标基因cDNA，实现低成本、高灵敏的批量组织水平检测。尽管需已知基因序列且通量有限，其在假设驱动的小规模研究（如神经递质受体表达验证）中仍不可替代。值得注意的是，qPCR常被用作高通量测序结果的验证工具，其引物设计需严格避免脱靶扩增。

RNA测序技术革命

全转录组分析

RNA-seq通过将RNA反转录为cDNA并进行高通量测序，实现了无偏见的全基因组表达谱分析。早期依赖桑格测序，现今基于NGS的技术凭借并行处理数百万序列的能力成为主流。

单细胞分辨率突破

微流控液滴条形码技术将测序推进到单细胞水平（scRNA-seq），解决了脑组织高度异质性的难题。与全细胞测序相比，单核测序（snRNA-seq）因神经元突触易损性更适用于脑研究，能捕获新转录RNA并减少解离偏差。研究显示，核与全细胞数据在基因表达层面高度一致。

长读长测序的独特优势

纳米孔测序通过电信号实时读取RNA分子，虽原始准确率较低，但其捕获全长转录本的能力对解析神经疾病相关剪接异常（如精神分裂症风险基因DISC1可变剪接体）至关重要。新兴的长读长单细胞技术已揭示大脑发育中保守的异构体多样性。

空间维度解析

空间转录组分为探针法（如MERFISH）和测序法（如Visium），前者可达亚细胞分辨率但需定制探针，后者实现全基因组覆盖但存在多细胞"斑点"问题。该技术在阿尔茨海默病研究中成功定位病理相关星形胶质细胞亚群。

表观遗传学测序

染色质可及性图谱

ATAC-seq利用Tn5转座酶标记开放染色质区域，快速低成本地识别调控元件。其单细胞版本（scATAC-seq）常与scRNA-seq联用，揭示神经元分化中染色质动态与基因表达的耦合关系。

蛋白-DNA互作解析

ChIP-seq通过抗体富集特定蛋白（如转录因子或组蛋白修饰）结合的DNA片段，但需交联且背景较高。CUT&RUN和CUT&Tag分别采用MNase和Tn5酶切，显著提高分辨率并降低样本量，已用于绘制皮层发育调控网络。

DNA甲基化检测

亚硫酸盐测序（BS）是5mC检测金标准，而氧化亚硫酸盐测序可区分5mC与5hmC。新开发的EM-seq通过酶促转化减少DNA损伤，适用于低输入样本，在神经发育甲基化动态研究中表现突出。

三维基因组与RNA互作

染色质构象捕获技术（Hi-C/PCHi-C）发现精神疾病风险非编码变异通过远程染色质环调控靶基因（如精神分裂症相关增强子接触突触基因）。CLIP-seq则揭示自闭症相关RNA结合蛋白（如RBFOX1）的剪接调控靶点网络。

实验设计与分析要点

统计严谨性

单细胞研究中"伪批量"分析（按细胞类型合并计数）可提高统计效力。差异表达工具DESeq2/edgeR/limma-voom需配合多重检验校正，而WGCNA能识别共表达模块（如应激反应相关基因簇）。

验证策略

空间验证技术从传统ISH发展到多重荧光原位杂交（如HCR），需注意RNA与蛋白定位可能不一致。建议用qPCR快速验证，再通过MERFISH等精确定位。

技术选择哲学

"更多数据未必更好"是核心准则——针对明确假设（如特定神经环路基因调控），qPCR可能比单细胞测序更高效；而探索未知机制时，多组学整合（如snRNA-seq+scATAC-seq）能揭示全新调控层级。关键是根据科学问题匹配技术分辨率与成本效益。