体内自组装SOD1-siRNA外泌体靶向治疗肌萎缩侧索硬化症的新策略

本研究针对肌萎缩侧索硬化症(ALS)治疗中药物递送效率低、靶向性差等难题，南京大学团队创新性地开发了基于合成生物学的体内自组装siRNA技术。研究人员通过改造肝脏作为生物反应器，成功实现SOD1-siRNA在循环外泌体(sEVs)中的自组装和神经元靶向递送，在SOD1G93A转基因小鼠模型中显著改善了运动功能、延缓肌肉萎缩并延长生存期。该研究为ALS等神经系统疾病的RNAi治疗提供了高效、低侵入性的递送新范式。

　　

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种致命的神经退行性疾病，患者运动神经元进行性退化导致肌肉萎缩和瘫痪。尽管1993年就发现超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变是重要致病因素，但近30年来临床治疗进展缓慢。当前基于反义寡核苷酸(ASO)的疗法如Tofersen需反复鞘内注射，存在分布局限、操作创伤大等问题；而腺相关病毒(AAV)载体则面临免疫原性挑战。如何实现高效、低侵入的靶向递送，成为ALS治疗研究的核心瓶颈。

南京大学医学院附属鼓楼医院分子诊断与治疗中心、生命科学学院的研究团队独辟蹊径，利用肝脏作为"生物工厂"，开发了体内自组装小干扰RNA(IVSA-siRNA)的创新策略。该研究设计合成包含CMV启动子、SOD1-siRNA支架和狂犬病毒糖蛋白(RVG)靶向模块的三联体结构，通过静脉注射后，肝脏细胞能持续产生携带RVG标记的外泌体，这些"智能快递"可穿越血脑屏障，精准递送SOD1-siRNA至脊髓和大脑皮层。相关成果发表在《Brain》杂志。

关键技术包括：1)构建靶向SOD1^G93A突变位点的特异性siRNA序列；2)设计CMV-RVG-siRNA合成载体实现肝脏特异性表达；3)采用超速离心结合免疫沉淀纯化血浆外泌体；4)使用PKH26标记和荧光原位杂交(FISH)追踪外泌体分布；5)通过AAV8载体实现长期表达；6)在SOD1^G93A转基因小鼠模型中系统评估治疗效果。

【设计靶向突变SOD1的合成构建体】

研究人员首先筛选出能特异性识别SOD1^G93A突变位点的siRNA序列，该序列与野生型SOD1仅单碱基错配。通过将siRNA嵌入miR-155前体支架，并融合RVG-Lamp2b靶向模块，构建出能指导外泌体靶向神经元的合成载体。体外实验证实，该构建体可高效沉默HEK293T细胞中SOD1^G93A-eGFP融合蛋白表达。

【体内自组装siRNA的功能验证】

静脉注射后，合成载体主要在肝脏富集。免疫沉淀实验显示，产生的SOD1-siRNA以外泌体形式存在循环系统中，而非与Ago2蛋白结合。通过ASGPR1抗体特异性捕获肝脏来源外泌体，证实了肝脏是sEV-SOD1-siRNA的主要来源。携带RVG标记的外泌体在脊髓和皮层中的富集量比非靶向外泌体高3-4倍。

【改善ALS模型小鼠表型】

在SOD1^G93A转基因小鼠中，每周2次静脉注射治疗10周后，CMV-RVG-siRNA组小鼠体重下降延缓40%，中位生存期从146天延长至185天。旋转棒和握力测试显示运动功能显著改善，肌肉纤维横截面积增加2.3倍。更重要的是，治疗组脊髓腹角中ChAT⁺运动神经元数量接近野生型水平，神经肌肉接头(NMJ)的完整性得到保持。

【分子机制解析】

Western blot显示脊髓中突变SOD1蛋白降低62%，免疫荧光证实皮层和脊髓中SOD1聚集体减少。同时，小胶质细胞(IBA1⁺)和星形胶质细胞(GFAP⁺)的异常激活被显著抑制，炎症因子水平下降。肌肉萎缩标志物Atrogin-1和MuRF-1表达量回调至正常范围。

【AAV载体实现长效治疗】

为克服重复注射的局限性，研究进一步开发了AAV8-CMV-RVG-siRNA策略。单次静脉注射后，小鼠脊髓中SOD1-siRNA可持续表达20周以上，治疗效果优于鞘内注射AAV9或Tofersen对照组，最大生存期延长至236天。

该研究突破性地将合成生物学与细胞外囊泡技术相结合，创立了"体内自组装-天然递送"的治疗新范式。与传统方法相比，这种策略具有三大优势：1)利用内源性外泌体递送系统，避免人工纳米载体的免疫原性；2)通过静脉注射实现无创治疗，克服鞘内注射的临床限制；3)RVG靶向模块确保中枢神经系统特异性分布。值得注意的是，该平台具有模块化特性，通过替换siRNA序列即可靶向不同SOD1突变或其他神经疾病相关基因。

研究也存在一定局限性，如在其他SOD1突变类型(如A4V、G85R)中的普适性有待验证，人类与小鼠血脑屏障的物种差异可能影响转化效果。未来需要优化外泌体产量和靶向效率，并探索临床级生产工艺。尽管如此，这项工作为ALS等神经系统疾病的基因治疗开辟了新途径，其"以宿主为生物反应器"的核心思路，对糖尿病、癌症等需长期蛋白治疗的疾病也具有重要启示意义。