铜催化叠氮-炔环加成反应构建β-半乳糖苷酶响应的环状反义寡核苷酸实现RNA切割的双重开关调控

为解决传统反义寡核苷酸(ASO)时空控制不足的难题，东京科学研究所Kento Miyaji团队开发了基于CuAAC反应的β-半乳糖苷酶响应型环状ASO。该研究通过拓扑约束和碱基配对抑制双重机制实现RNase H介导的RNA切割"关-开"调控，为精准基因沉默治疗提供新策略。

　　

基因治疗领域长期面临一个关键挑战：如何像精准制导武器那样，在特定时间和位置激活治疗性核酸分子？传统反义寡核苷酸(ASO)一旦进入体内就会持续作用，这种"全天候工作模式"可能导致脱靶效应和毒副作用。东京科学研究所(Institute of Science Tokyo)的Kento Miyaji、Keita Takeuchi和Kohji Seio团队在《Biochimie》发表的研究，为这个难题提供了创新解决方案。

研究人员聚焦于硫代磷酸酯(PS)修饰的gapmer型ASO——这类分子由中央DNA区域和两侧2′-OMe修饰RNA组成，能招募RNase H切割靶RNA，但缺乏精确调控能力。此前尝试主要通过化学修饰抑制碱基配对实现"关闭"状态，但需要多重修饰且效果有限。

该研究创新性地结合两种调控机制：在碱基层面，通过O⁴-胸苷修饰干扰沃森-克里克配对；在结构层面，利用铜催化叠氮-炔环加成反应(CuAAC)构建共价环状拓扑约束。关键技术包括：1)设计含炔基的β-半乳糖苷酶响应型胸苷磷酰胺单体；2)优化PS修饰ASO的CuAAC环化条件以最小化脱硫副反应；3)建立双氟苄自消除连接子串联结构增强酶切效率；4)通过熔解温度(T_m)和RNase H切割实验验证调控效果。

在"化学设计"部分，研究人员开发了含串联双氟苄连接子的胸苷衍生物，通过延长连接子与ASO骨架的距离，显著提升β-半乳糖苷酶对半乳糖基的识别效率。MALDI-TOF MS证实，使用THPTA配体和TCEP还原剂的CuAAC体系可将环化产率提升至93%，同时将脱硫副产物控制在5%以下。

"熔解温度分析"显示，三重交联(6-10-14位点)的环状ASO(cASO 16)使T_m降低35.3°C，显著高于线性对照。热力学参数揭示，9-nt大环结构(cASO 15)导致124.5 kJ/mol的焓损失，证实拓扑约束对双链稳定的破坏作用。

关键的"RNase H介导RNA切割"实验证明，环状结构产生协同抑制：在亚化学计量条件(ASO:RNA=0.1:1)下，cASO 16完全阻断RNA切割，而对应线性ASO仅抑制86%。酶切激活实验表明，含串联连接子的cASO 19/20在2小时内被β-半乳糖苷酶完全激活，恢复与天然ASO相当的切割活性。

这项研究的意义在于：1)建立了PS修饰ASO高效环化的通用方法；2)首次实现拓扑约束与碱基修饰协同调控；3)串联连接子设计突破酶切效率瓶颈。这种"双重保险"设计特别适用于β-半乳糖苷酶过表达的肿瘤和衰老相关疾病，为发展下一代智能核酸药物奠定基础。研究展现的模块化设计思路，可通过替换酶响应基团拓展至其他疾病微环境激活系统。