基于DNA-聚精氨酸探针的纳米孔传感技术超灵敏检测Dam甲基转移酶活性及其抑制

本文推荐一种新型无标记单分子检测策略：利用DNA-聚精氨酸（DNA-R5）探针结合α-溶血素纳米孔（α-HL），实现Dam甲基转移酶（Dam MTase）的超灵敏检测（LOD 0.00005 U/mL）。该技术通过DNA-R5特征性振荡信号（oscillating pattern）特异性识别酶活性，优化pH 8.0/140 mV条件，整合磁珠（MBs）富集，在血清环境中验证了临床适用性，并为抗生素（如青霉素）抑制研究提供新平台。

　　

亮点

本研究首次将DNA-R5探针应用于纳米孔检测领域。相较于其他DNA-肽探针（如DNA-H5），DNA-R5展现出独特的振荡信号特征（电流在双稳态间快速切换），而无需复杂电极修饰。通过"点击化学"高效合成的发夹DNA-R5（DNA2-R5）经Dam MTase甲基化和DpnI切割后释放ssDNA-R5，产生可识别的振荡信号（非传统阻塞信号）。突变蛋白验证、发夹序列优化及pH/电压条件筛选（pH 8.0，140 mV）证实了机制可靠性。

材料

所有寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司提供，α-溶血素（α-HL）及其突变体M113R按文献方法制备。实验使用1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPhPC）脂质膜体系，并采用n-十六烷/戊烷混合溶液形成单层膜。

检测原理

ssDNA-R5（DNA1-R5）在纳米孔中产生特征性振荡信号（图S1），而带正电荷的DNA-H5无此特性（图S2）。发夹DNA2-R5的5'端修饰R5（¹R₅）后，经Dam/DpnI处理释放ssDNA-R5。该结构在电场驱动下进入α-HL纳米孔时，精氨酸残基与孔道内壁相互作用导致电流振荡——这种"分子刹车"效应成为超灵敏检测的基础。

结论

DNA-R5纳米孔平台实现了Dam MTase的超灵敏检测。通过高斯/指数分布分析信号幅值和驻留时间，结合突变蛋白（M113R）验证了精氨酸-孔道相互作用机制。磁珠富集技术将检测限降低至0.00005 U/mL，青霉素抑制实验证实了其在药物筛选中的潜力，为临床诊断和表观遗传研究提供了新工具。