新型正向荧光电压探针HVI+的开发及其在可兴奋细胞与组织中的高灵敏度成像应用

本研究针对现有电压荧光探针负向响应导致静息态背景信号高的问题，开发出正向响应混合电压探针HVI+-Cy3b（灵敏度55% ΔF/F0 per 100 mV），成功实现心肌细胞动作电位波形精确记录及胰岛α/β细胞电活动同步监测，为复杂组织电生理研究提供新型工具。

　　

在探索生命活动的奥秘中，细胞膜电位动态犹如生物电的"语言"，支配着从神经元通讯到心脏跳动的关键生理过程。传统电压成像技术面临两大困境：一是多数荧光探针在静息态发出强光（负向响应），造成背景干扰；二是运动伪影严重影响心肌细胞等动态组织的测量精度。更棘手的是，像胰岛这类异质性组织中，不同类型细胞对葡萄糖的差异化电响应机制仍存在争议。

为突破这些技术瓶颈，北京大学的研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表创新成果。他们通过理性设计Ace2视蛋白突变体，结合化学连接技术开发出正向响应混合电压指示剂HVI⁺。当细胞膜去极化时，该探针亮度增强（正向响应），静息态背景荧光降低50%，光稳定性提升70%（半衰期736秒）。特别是HVI⁺-Cy3b变体展现出22.3% ΔF/F₀ per AP的超高灵敏度，远超同类探针Positron₅₂₅（5.9%）。

研究采用三大关键技术：1）基于PRIME（蛋白质重组结合化学标记）技术的位点特异性荧光标记；2）双色比率成像（COT-Cy3/Cy5）消除心肌细胞搏动伪影；3）双极性多重成像（DUPLEX）实现胰岛α/β细胞单通道同步监测。实验系统涵盖原代海马神经元、大鼠心肌细胞及小鼠胰岛模型。

【工程化HVI⁺】

通过系统筛选Ace2视蛋白的质子供体（D92L）和释放位点（E199I）突变，获得三重突变体HVI⁺(C81D D92L E199I)。电生理测试显示其响应速度极快（上升时间常数2.24 ms），且线性响应范围覆盖-100至100 mV。

【心肌电生理应用】

创新性采用COT修饰染料（提升光稳定性）的双色比率成像，成功解析4-AP药物处理导致的心肌动作电位时程延长（APD₅₀从127增至242 ms）。该方法将异质性运动伪影降低至2.20±0.11的稳定比率。

【胰岛细胞研究】

通过preproglucagon和胰岛素启动子分别靶向α/β细胞，首次在完整胰岛中观察到葡萄糖的双向调控：13 mM葡萄糖使β细胞放电频率提升3倍，而α细胞呈现抑制（45%）与兴奋（35%）的异质性响应，揭示胰岛内复杂的旁分泌调控网络。

这项研究不仅提供了迄今最灵敏的正向电压探针，更建立了跨尺度电生理研究平台。HVI⁺的低背景特性使密集标记组织成像成为可能，而DUPLEX技术突破了传统电压成像的细胞类型限制。特别在糖尿病研究领域，同步捕获α/β细胞电活动为解析葡萄糖稳态机制提供了全新视角。未来通过优化脂蛋白连接酶（LplA）的体内递送，该技术有望拓展至在体电生理研究，为神经退行性疾病和心律失常等重大疾病的机制研究注入新动能。