AND-1调控R-loop动态平衡的新机制：克服乳腺癌内分泌耐药的关键靶点

本研究揭示了DNA结合蛋白AND-1通过直接结合R-loop结构并增强RNase H1的核酸内切酶活性，在调控R-loop动态平衡中的关键作用。研究人员发现AND-1缺失会导致乳腺组织R-loop积累，并通过破坏雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌细胞中ESR1基因增强子区域的R-loop调控来降低ESR1表达，从而克服芳香化酶抑制剂耐药性。这项发表于《Science Advances》的研究为治疗内分泌耐药性乳腺癌提供了新的治疗策略。

　　

在生命科学领域，R-loop这种由RNA链侵入双链DNA形成的三链结构，既是多种细胞通路必需的调控元件，又是基因组不稳定的潜在源头。当R-loop动态平衡被打破时，会导致DNA双链断裂、染色体易位等严重后果，与神经系统疾病、多种癌症以及药物耐药性密切相关。特别是在雌激素受体阳性（ER⁺）乳腺癌中，约30%接受芳香化酶抑制剂（AI）治疗的患者会因ESR1基因突变产生获得性耐药，成为临床治疗的重大挑战。

为探索解决这一难题的新途径，研究人员将目光投向了一个鲜为人知的DNA结合蛋白AND-1（又称WDHD1）。这个在DNA复制和损伤修复中起关键作用的蛋白，其酵母同源物Ctf4曾被报道与R-loop调控相关，但具体机制始终成谜。更引人注目的是，在乳腺癌中AND-1呈现高表达特征，这使其成为极具潜力的治疗靶点。

研究人员首先通过免疫荧光和斑点印迹实验证实，AND-1缺失会导致细胞核内R-loop显著积累。精巧设计的邻近连接实验（PLA）和染色质免疫沉淀（ChIP）揭示了AND-1与R-loop的直接相互作用，而电泳迁移率变动分析（EMSA）则证明其C端HMG结构域是结合R-loop的关键。进一步研究发现，AND-1不仅能通过SepB结构域与RNase H1结合，促进后者向R-loop的募集，还能显著增强RNase H1的核酸内切酶活性——这一双重调控机制通过创新的荧光底物切割实验得到完美验证。

研究最精彩的发现当属AND-1第826位苏氨酸（T826）磷酸化的调控作用。这个由ATR激酶催化的修饰，被证实是AND-1结合R-loop、招募RNase H1并激活其切割活性的必要条件。研究人员构建了T819A突变小鼠（对应人类T826），在乳腺上皮中观察到显著的R-loop积累，为AND-1的体内功能提供了直接证据。

在转化医学方面，研究团队发现AND-1通过调控ESR1基因上游调控元件（ESR1-RE）的R-loop水平来控制ESR1表达。使用小分子抑制剂CH3或临床已批准的药物bazedoxifene acetate（BZA）靶向AND-1，可有效降低ER-α蛋白水平，恢复携带Y537S、D538G等ESR1突变乳腺癌细胞对letrozole的敏感性。动物实验进一步证实，联合用药能显著抑制耐药肿瘤生长，为临床克服内分泌耐药提供了全新策略。

关键技术方法包括：CRISPR-Cas9基因编辑构建AND-1条件性敲除和T819A点突变小鼠模型；DNA-RNA免疫共沉淀（DRIP）检测特定基因组位点R-loop水平；荧光报告系统定量RNase H1酶活；以及基于患者来源异种移植（PDX）模型的药效评估。

研究结果部分：

"AND-1直接结合R-loop并参与其调控"证实AND-1通过HMG结构域特异性识别R-loop结构；

"AND-1与RNase H1相互作用并促进其向R-loop募集"阐明SepB结构域介导的蛋白互作机制；

"AND-1刺激RNase H1的核酸内切酶活性"通过体外切割实验揭示其酶活调控功能；

"AND-1 T826磷酸化对其R-loop调控功能至关重要"发现ATR依赖的翻译后修饰开关；

"AND-1是维持体内R-loop水平的关键因子"利用基因工程小鼠提供体内证据；

"AND-1通过抑制ESR1-RE区域的R-loop调控ESR1表达"建立表观遗传调控新机制；

"抑制AND-1克服AI耐药"展示转化医学价值。

这项研究不仅首次阐明了AND-1调控R-loop动态平衡的分子机制，更开创性地将其与乳腺癌内分泌治疗耐药相联系。特别值得注意的是，研究所用的BZA是已获FDA批准治疗骨质疏松的药物，这为快速推进临床转化提供了可能。该成果为理解R-loop相关疾病机制提供了新范式，也为克服ESR1突变导致的治疗耐药开辟了极具临床应用前景的新途径。