精准发酵牛奶蛋白下游加工中甘露聚糖干扰与纯化效率研究：以Komagataella phaffii为表达系统的挑战与突破

本研究针对精准发酵牛奶蛋白下游加工成本高的行业痛点，系统评估了Komagataella phaffii表达的β-乳球蛋白(rBLG)、αs1-酪蛋白(rCSN)和乳铁蛋白(rLTF)的理化特性，发现甘露聚糖(52-66% d.b.)是主要杂质。通过比较等电点沉淀、阴离子交换色谱(AEX)和膜分离三种纯化方法，揭示电荷分离法可提升蛋白纯度至64-81%，为食品工业提供经济高效的纯化策略。

　　

随着全球对动物福利和可持续食品生产的关注，利用微生物工厂生产重组牛奶蛋白成为研究热点。Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）作为高效的外源蛋白表达系统，已成功生产β-乳球蛋白(rBLG)、α_s1-酪蛋白(rCSN)和乳铁蛋白(rLTF)等牛奶蛋白。然而，下游加工成本占生产总成本的60-80%，其中杂质去除是关键瓶颈。荷兰瓦赫宁根大学食品工艺工程实验室的研究团队在《Future Foods》发表论文，首次系统揭示了K. phaffii发酵液中甘露聚糖的干扰机制，并评估了不同纯化策略的效率差异。

研究采用傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)分析蛋白二级结构，通过高效尺寸排阻色谱(HPSEC-UV/RI)测定分子量分布，结合高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)解析糖组成。表面电荷特性通过ζ电位分析，蛋白质纯度通过BCA法和杜马斯定氮法双重验证。关键实验包括：等电点沉淀(pH 2-11梯度)、制备型阴离子交换色谱(AEX-LC)分级，以及甘露聚糖酶解实验。

研究结果部分：

1. 总体组成与蛋白质构象

   FTIR显示重组蛋白与动物源参照物二级结构相似度达95%，但rCSN存在8%的α-螺旋缺失。甘露聚糖在1200-950 cm^-1呈现特征峰，占干重的52-66%。

2. 碳水化合物特性

   HPSEC揭示甘露聚糖分子量跨度大(2-242 kDa)，HPAEC证实其含75-87%甘露糖。rLTF样品中检测到最高分子量组分(242 kDa)。

3. 蛋白质特性

   LC-MS发现rBLG存在信号肽残留(19.3-19.5 kDa)，rCSN存在糖基化修饰(21.8-22.1 kDa)，rLTF糖基化程度高于动物参照(83.9-84.6 kDa)。

4. 表面电荷

   甘露聚糖使重组蛋白ζ电位曲线整体负移，rLTF的等电点从预期的8.58降至表观值2.82。

5. 纯化效率

   AEX使蛋白纯度提升至64-81%，但回收率仅32-37%；等电沉淀仅对rCSN有效(77%纯度)；膜分离因蛋白与甘露聚糖尺寸重叠而失效。

该研究创新性地指出：K. phaffii发酵液中甘露聚糖的复杂特性（多分散性、强负电荷）是下游加工的主要挑战。特别值得注意的是，rCSN的糖基化修饰改变了其电荷行为，这为理解重组酪蛋白功能差异提供了新视角。研究提出的电荷分离优先策略，相比传统尺寸分离更经济高效，尤其适用于食品级蛋白生产。未来研究可聚焦甘露聚糖合成调控或开发新型食品级沉淀剂，这对降低精准发酵食品成本具有重要产业意义。