成纤维细胞共培养技术显著延长成年猫小肠类器官存活周期并支持弓形虫发育研究

本研究创新性地采用人包皮成纤维细胞（HFF）共培养技术，成功解决了成年猫小肠类器官（enteroids）培养中存在的增殖缓慢和早衰难题。通过丝裂霉素C（MMC）灭活的HFF feeder细胞显著提升猫空肠/回肠类器官存活时间至9个月，并促进类器官直径增大至1-2 mm。该体系成功支持弓形虫（T. gondii）前性发育阶段标志物GRA11b的表达，为替代活猫实验研究猫科特异性病原体提供了重要技术突破。

　　

研究背景与技术瓶颈

成年猫小肠类器官培养长期面临增殖受限和早衰问题，传统培养基中添加生长因子（如FGF-2/-4/-10、IGF-1等）均未能有效解决。既往研究发现，猫类器官中波形蛋白（VIM）阳性间充质样细胞的消失与培养衰退相关，暗示间质微环境的关键作用。

创新方法设计

研究团队开发了人包皮成纤维细胞（HFF）共培养体系：

1. 细胞灭活：采用丝裂霉素C（MMC）处理2小时阻断HFF增殖

2. 共培养架构：在24孔板中铺设灭活HFF单层，覆盖玻璃盖片阻隔直接接触

3. 培养基优化：在含50% L-WRN条件培养基（含Wnt3a/R-spondin/noggin）基础上，添加10 μM SB202190、0.5 μM A-83-01等组分

突破性成果

存活周期：

• HFF共培养使猫空肠类器官存活时间从<5周延长至288天（45代）

• 回肠类器官存活率存在个体差异（1/3成功案例）

形态学改变：

• 直径从200-700 μm增至1-2 mm

• 维持囊状（cystic）结构，仅个别样本出现出芽（budding）表型

跨物种验证：

小鼠类器官对HFF响应较弱，仅回肠样本直径显著增加

弓形虫感染模型应用

采用21天预成熟的类器官单层感染T. gondii II型株（ME49 ?hpt luciferase/TgShSp1）：

• 感染效率：5天后可检测到前性发育标志物GRA11b

• 关键发现：成熟单层的GRA11b⁺空泡比例（20%-30%）显著高于10天单层

机制探讨与未来方向

1. 种属特异性：猫可能缺乏潘氏细胞（Paneth cell）或需独特生长因子组合

2. 分化调控：GRA11b低表达可能与类器官去分化状态相关

3. 技术拓展：撤除HFF后部分样本仍可长期存活，提示阶段性共培养可行性

研究意义

该技术为猫冠状病毒、Hammondia hammondi等猫科特异性病原体研究提供替代动物模型，有望显著减少实验猫用量。共培养策略或可推广至其他难培养物种的肠道类器官体系。

（注：全文数据均源自原文实验，包含4只猫的空肠/回肠类器官追踪、2种T. gondii株系感染实验及小鼠类器官对照）