大肠杆菌Rac原噬菌体KilR蛋白的双重抑制机制：靶向细胞分裂与延伸机器的分子机制解析

这篇研究揭示了大肠杆菌Rac原噬菌体编码的毒性蛋白KilR通过其C端非结构域同时抑制FtsZ介导的细胞分裂和MreB介导的细胞延伸。研究发现KilR在氧化应激条件下通过双重靶向作用（dual inhibitor）引发细胞形态异常（filamentation和rounding），其C端12个氨基酸的长度依赖性功能为理解细菌-噬菌体共进化提供了新视角。

　　

KilR介导的毒性作用与细胞形态异常

研究团队构建了阿拉伯糖诱导的KilR表达系统，发现其毒性呈现浓度依赖性：低浓度（0.01%阿拉伯糖）导致细胞丝状化（filamentation），高浓度则引发柠檬形或球形细胞（lemon-shaped/round cells）。相衬显微镜显示，这种双相形态变化与已知的双重抑制剂CptA和CbtA毒素表型相似。值得注意的是，使用前人报道的pSA97质粒验证时，KilR同样展现出浓度依赖的形态学效应。

C端非结构域的功能解密

AlphaFold3预测显示KilR含N端（7aa）和C端（12aa）两个非结构域。通过系列截断实验发现：缺失C端12aa（Δ12C）完全消除毒性，而仅缺失最后3aa（Δ3C）的突变体保留毒性但丧失细胞延伸抑制能力。引人注目的是，将末端3个氨基酸（Glu-Ser-Trp）替换为丙氨酸的KilR*变异体完全恢复双重抑制功能。Western blot证实这些表型差异非表达量所致，提示C端长度（非特定序列）决定功能强度。

与λ Kil的靶向机制分野

在ftsA*ΔzipA突变株中，λ Kil毒性完全消失，但KilR仍保持强毒性。形态学比较显示：λ Kil仅引起剂量依赖性丝状化，而KilR在高浓度时引发细胞变圆。这一关键差异暗示两者虽都靶向FtsZ，但KilR存在独特次级靶点。鉴于圆形细胞是MreBCD系统缺陷的特征表型，研究推测细胞延伸机器可能是KilR的第二靶标。

细胞骨架蛋白的共定位现象

mCherry-KilR融合蛋白显示其呈弥散性胞质分布，但共表达mYpet-MreBCD时，KilR被招募至膜相关丝状结构。然而超表达MreBCD仅部分缓解细胞变圆表型，无法像FtsZ超表达那样完全中和KilR毒性。荧光显微技术揭示：KilR表达导致ZapA-GFP（FtsZ标记物）斑点化、MreB-RFP^SW形成异常聚集体，而Δ3C变异体仅破坏FtsZ定位，这与其表型完美对应。

氧化应激下的生理功能验证

在3-7 mM H₂2₂处理条件下，野生型菌株中FtsZ-mCherry和MreB-msfGFP^SW定位显著紊乱，而ΔkilR突变株表现出更强的抗干扰能力。定量分析显示：3mM H₂O₂即可显著影响FtsZ定位（p<0.05），而MreB异常需要更高浓度（5mM，p<0.01）。这证实染色体编码的KilR在生理应激条件下确实双重调控细胞骨架。

研究创新性与未解之谜

该研究首次确立KilR作为噬菌体编码的双重形态发生抑制剂，其C端非结构域如同"分子开关"：全长维持双重抑制，截短版实现功能分离。特别有趣的是，KilR与MreBCD的相互作用模式不同于经典毒素-抗毒素系统——虽能共定位却无法被中和，这可能源于其对FtsZ和MreB的"双管齐下"作用。遗留的核心问题包括：KilR与MreBCD的精确结合位点，以及其如何协调两种骨架系统的共抑制。未来通过冷冻电镜解析KilR-靶蛋白复合物结构，或将揭示这一古老噬菌体元件的精准分子武器设计。