流体剪切力调控的阳离子离子通道激活型仿生骨膜支架：无药物免疫激活促进骨再生的新策略

本研究创新性地结合3D打印与静电纺丝技术，开发出具有仿生骨/骨膜结构的复合支架（PAPC），通过流体剪切应力（FSS）动态调控巨噬细胞M1/M2极化（涉及钾离子通道K+等关键靶点），同时促进间充质干细胞（hBMSCs）成骨分化，为免疫缺陷患者的骨再生提供了兼具机械传导与免疫调节功能的双效平台。

　　

工程化仿生骨/骨膜样构建体

研究团队通过融合3D打印和静电纺丝技术，构建了模拟皮质骨内部与骨膜外层的复合支架。核心采用75%聚己内酯（PCL）室温3D打印，表面经L-精氨酸修饰以改善疏水性，外层包裹含阳离子纤维素纳米晶体（cCNC）的聚乙烯醇（PVA）纳米纤维。该结构形成直径50-80μm的纤维网络，在湿度处理下产生随机分布与定向排列并存的纳米纤维"岛屿"。力学测试显示支架垂直方向抗压强度达719kPa，杨氏模量0.1195Pa，适合非承重骨修复应用。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实精氨酸通过酰胺键（1549cm^-1）成功接枝，降解实验表明在pH7环境下21天重量损失约30%。

流体剪切力增强细胞活性

定制化生物反应器系统（流速0.6mL/min）模拟生理流体剪切应力（FSS）时，人类骨髓间充质干细胞（hBMSCs）在PCL核心保持高增殖活性（Ki67阳性率>80%），而RAW264.7巨噬细胞在纳米纤维表面呈现扁平化形态（铺展面积减少40%）。qPCR检测发现精氨酸修饰组（PA）机械敏感通道Piezo1/2表达显著上调，但PVA@cCNC组（PAPC）中该通道表达受抑。值得注意的是，谷胱甘肽（GSH）活性分析显示PAPC组抗氧化能力较TCPS对照组提高2.1倍，暗示cCNC可能通过调节氧化应激影响细胞行为。

骨形成与免疫调控协同效应

在FSS作用下，PAPC支架表现出最强的成骨诱导能力：7天时碱性磷酸酶（ALP）活性升高3.2倍，14天钙结节沉积量增加4.5倍（通过茜素红染色验证）。转录组分析揭示SPP1（骨桥蛋白）和SPARC基因持续高表达，而Runx2在PA组显著下调。巨噬细胞呈现动态极化特征：平滑区域主要诱导M1表型（iNOS⁺），纳米纤维区域则促进M2转化（CD163⁺表达达600倍）。炎症因子阵列检测到CCL3和TNFR2分泌量分别增加8.3倍和5.7倍，证实支架可激活先天免疫应答。

抗菌性能与机制解析

在E.coli共培养实验中，PAPC组在FSS条件下使细菌存活率降低87%（菌落形成单位测定），FE-SEM观察到巨噬细胞伪足延伸并包裹细菌的现象。生物膜实验显示36小时后细菌生物膜形成被抑制92%。差异基因表达（DEGs）分析鉴定出85个离子通道相关基因，其中钾通道KCNN4上调4.1倍，钙通道TRPV6下调2.8倍。基因本体（GO）分析显示"模式识别受体活性"通路显著富集（p<0.001），与TLR4和IL15基因的协同上调共同构成抗菌防御网络。

转录组学的深层启示

RNA测序发现FSS处理使PAPC组产生897个上调基因（vs静态组650个），其中367个基因与TCPS对照组共享。关键发现包括：①钾离子通道（如KCNJ15）通过调节膜电位影响巨噬细胞极化；②机械敏感蛋白PIEZO1与细胞骨架重组直接相关；③TGF-β1是唯一在机械刺激下持续高表达的M2标志物。这些结果揭示了阳离子纳米材料（cCNC）通过电荷相互作用调控离子通道（特别是K⁺和Ca²⁺通道）的新机制，为理解机械-免疫交叉对话提供了分子基础。

讨论与展望

该研究突破性地将流体力学刺激与纳米拓扑线索相结合，首次证实离子通道（尤其是KCa3.1和Kv1.3亚型）在支架介导的巨噬细胞动态极化中的核心作用。相比传统静态支架，PAPC构建体能在24小时内实现M1向M2的表型转换，这种快速响应特性对急性感染控制具有重要意义。局限性在于目前对巨噬细胞亚群比例的精确控制仍具挑战性，未来可通过优化cCNC负载量（当前为1%）和流体参数（0.1-0.5mL/min梯度）进一步提高可调控性。该技术为开发"智能"骨移植材料开辟了新途径，特别适用于糖尿病骨缺损等免疫微环境异常的情况。