阿拉斯加洋流岩鱼环境DNA（eDNA）D-loop引物组的开发与验证：渔业管理新工具的突破

这篇研究报道了针对阿拉斯加洋流岩鱼（Sebastes sp.）开发的eDNA D-loop特异性引物组，通过环境DNA（eDNA）宏条形码技术解决了近缘物种鉴定难题。该引物组在42种岩鱼中实现90%准确率，并通过模拟群落（mock community）和实地样本验证了其在高/低浓度eDNA中的稳定性，为岩鱼种群监测提供了高分辨率工具，尤其适用于难以拖网调查的岩石栖息地。

　　

摘要

研究团队针对阿拉斯加洋流岩鱼开发了首个靶向线粒体D-loop区域的eDNA引物组（SebDLoop），其~206 bp扩增片段在42种测试岩鱼中实现95%准确鉴定，显著优于通用鱼类引物（如MiFish）和加州特化引物（MiSebastes）。通过模拟群落实验揭示了18种岩鱼的扩增偏倚（如S. polyspinis效率+0.029 vs S. nebulosus -0.07），并建立定量校正模型。在阿拉斯加渔业科学中心水族馆（含11种岩鱼）和阿留申群岛拖网调查的eDNA样本中，该引物组分别检测到10种和5种岩鱼，与目视观察及拖网数据高度吻合。

1 引言

岩鱼属（Sebastes）作为北太平洋关键经济物种，其形态相似性和栖息地复杂性（如非拖网able岩石区）使传统调查面临挑战。现有eDNA引物在区分阿拉斯加特有种（如S. melanops与S. flavidus、S. polyspinis与S. ciliatus/variabilis复合体）时分辨率不足。研究团队选择D-loop区域——该区域在岩鱼中变异度最高（平均种间差异37 bp），通过整合NCBI数据库和271条新测序数据构建了涵盖104种岩鱼的参考序列库。

2 方法

2.1 引物设计与验证

引物设计采用Geneious Prime软件，在D-loop保守区引入简并碱基（如正向引物ATNACCATATCTAGGNTTNAACC）。通过87个S. polyspinis、48个S. variabilis和70个S. ciliatus的低覆盖全基因组数据（lcWGS）构建单倍型网络，发现S. polyspinis特有单倍型（仅2-3%存在于近缘种）。组织样本验证使用171个个体，采用巢式PCR（nested PCR）提升灵敏度。

2.2 应用测试

水族馆样本通过0.45 μm硝酸纤维素膜过滤，Longmire缓冲液保存；阿留申群岛样本在44-96 m深度采集。文库制备采用Illumina Nextera接头，MiSeq 2×150 bp测序。生物信息学分析使用Dadasnake流程，ASV分类基于95%相似度阈值。

3 结果

3.1 验证数据

组织样本鉴定准确率达95%，但S. ciliatus/variabilis、S. emphaeus/variegatus仍无法区分。单倍型网络显示S. polyspinis可通过高频单倍型（Hap1占82%）间接鉴定。

3.2 扩增偏倚

近岸物种S. nigrocinctus在模拟群落中 reads比例从19.77%飙升至55.29%，而S. melanops从20%降至8%。引物-模板错配分析显示，仅S. nebulosus在SebDLoop引物存在1个错配。

3.3 实地检测

水族馆样本中表层活动的S. alutus（3条个体）在所有重复中检出，而底栖S. nebulosus（1条）仅33%检出率。阿留申样本中S. alutus和S. polyspinis检出率（54%/46%）与其拖网丰度排名一致，但300 m以深的S. borealis未检出，符合eDNA垂直分布规律。

4 讨论

4.1 技术突破

相比MiSebastes引物（仅区分加州63/80种岩鱼），新引物在阿拉斯加关键种（如S. polyspinis）分辨率提升显著。通过单倍型频率辅助鉴定（如S. polyspinis Hap1）为近缘种区分提供新思路。

4.2 应用前景

该技术可整合至珊瑚礁鱼类调查，但需注意：①巢式PCR可能引入嵌合体，建议高浓度样本直接用SebDLoop单轮扩增；②对S. diaconus/entomelas等剩余复合体需开发qPCR补充方案。

5 结论

SebDLoop引物组填补了阿拉斯加岩鱼eDNA监测技术空白，其兼容高低浓度样本的特性使其适用于从近岸生态调查到商业渔业评估的多场景应用。未来可通过扩大参考数据库（特别是S. diploproa）进一步提升准确性。