综述：顺式调控元件的系统鉴定与园艺应用

这篇综述系统总结了顺式调控元件（CREs）的高通量鉴定技术（如ChIP-seq、DAP-seq、ATAC-seq等），阐述了CREs通过转录因子结合位点（TFBSs）调控园艺作物农艺性状（如果实成熟、色泽、抗逆性）的分子机制，并探讨了基于CRISPR/Cas和人工智能（AI）的CRE编辑策略在育种中的应用前景。

　　

引言

高等植物中，尽管所有细胞共享相同基因组，但基因表达剂量和时空模式的差异由顺式调控元件（CREs）精确控制。CREs是6-20 bp的DNA片段，作为转录因子（TFs）的分子开关，通过增强子、启动子等功能模块调控基因表达。随着高通量技术的发展，CRE研究已从单一位点分析迈向系统解码基因调控网络（GRNs）的新阶段。

顺式调控元件的系统鉴定

基于转录因子结合位点的方法

CREs本质是TFs的结合位点（TFBSs）。传统技术如电泳迁移率实验（EMSA）和DNA足迹法通量低，而二代测序推动的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和DNA亲和纯化测序（DAP-seq）实现了全基因组TFBS定位。DAP-seq通过重组TF与基因组DNA孵育富集结合位点，已构建拟南芥529个TF的结合图谱。但其使用裸露DNA，缺乏染色质环境。改良技术如双链DAP-seq（dDAP-seq）可解析TF异源二聚体结合特性。

ChIP-seq利用抗体捕获内源TF结合的DNA，但需高质量抗体且样本量大。其衍生技术如半体内ChIP-seq（semi-in vivo ChIP-seq）通过表位标签规避抗体需求；CUT&Tag通过Tn5标记将细胞需求降至100-1000个。植物特异性优化技术eChIP和aChIP解决了细胞壁导致的核分离效率问题。

为解析TF结合特异性，蛋白结合微阵列（PBM）和指数富集配体系统进化（SELEX）使用随机DNA库。SELEX可捕获间距80 bp的TF二聚体结合，而甲基化SELEX（EpiSELEX-seq）进一步整合DNA甲基化影响。

基于表观遗传标记的方法

活跃CREs常伴随特定组蛋白修饰和开放染色质。动物中H3K4me3标记活跃启动子，H3K27ac标记增强子；而植物中H3K4me1修饰基因体，H3K27ac富集于启动子近端。染色质开放性分析技术如ATAC-seq和DNase-seq可一次性定位所有类型CREs，其信号强度受酶切偏好性影响（如Tn5偏好回文序列）。

三维基因组技术（Hi-C、Micro-C）通过染色质互作揭示CRE与靶基因的调控关系。植物中，开放染色质富集Hi-C（OCEAN-C）将FAIRE-seq与Hi-C结合，显著提升大基因组中远端增强子的靶标关联效率。

基于序列活性的方法

活性TF鉴定（ATI）通过EMSA筛选核蛋白结合的CRE序列，植物优化版Sea-ATI仅需50 mg组织。大规模并行报告 assay（MPRA）和自转录活性调控区测序（STARR-seq）评估CRE转录活性，但需瞬时转染。新型沉默子筛选STARR-seq（Ss-STARR-seq）填补了弱活性CRE的检测空白。

基于基因组学的方法

进化保守的非编码序列（CNSs）和群体基因组学（GWAS、eQTLs）可间接预测CREs。例如，牡丹的GWAS与cis-eQTL整合分析发现了调控花瓣数的CREs。单细胞技术（scATAC-seq、scCUT&Tag）进一步解析了细胞类型特异性CREs，但植物因细胞壁限制多聚焦于幼嫩组织。

园艺作物中的顺式调控元件

果实成熟调控

番茄中，RIN基因启动子的EIN3结合位点通过DNA去甲基化激活；Cnr突变体的286 bp区域超甲基化阻断了RIN与CArG基序结合，导致成熟障碍。香蕉MaNAP1-MaMADS1双环路通过乙烯响应元件协调成熟相关基因表达。苹果MdNAC18.1启动子的61 bp重复序列通过自抑制精确调控成熟进程。

果实形态与色泽

番茄FW2.2和FW3.2启动子的SNPs降低表达导致果实增大；SUN基因因转座子插入获得防御素基因DEFL1的增强子，驱动果实伸长。苹果MdMYB1启动子的LTR转座子redTE通过环境响应TF招募增强红色表型；柑橘Ruby基因旁的Copia转座子Tcs1介导低温依赖性花青素积累。

抗逆性调控

香蕉冷胁迫下WRKY通过W-box簇远程激活褐变相关基因；高温诱导MaMYB60泛素化降解，抑制叶绿素降解保留绿色。葡萄光响应下VvHYH结合G-box调控蜡质合成基因，提升采后品质。

CREs在育种中的应用

相比编码区编辑，CRE工程具备三大优势：剂量可控性、组织特异性减少多效性、快速进化潜力。柑橘中CRISPR编辑LOB1启动子的PthA4效应子结合位点，获得溃疡病抗性；番茄通过多重编辑CLV3、WUS等基因启动子实现产量性状定量优化。人工智能辅助的CRE设计正推动合成生物学发展，如热激响应元件编程番茄蔗糖转运基因LIN5的时空表达。

结论

CRE研究在生化特性、基因组定位和功能解析方面取得突破，但神经网络模型的生物学解释仍是挑战。结合高效编辑平台和自然种质资源，CRE工程将助力园艺作物的精准育种，应对气候变化与营养需求的双重挑战。